它們的組合。
[0125] 因此，本發(fā)明在實(shí)施方案中提供本文所述的濃縮的單克隆抗體制品在制備用于 治療任何上述的紊亂及類似紊亂的藥物中的用途。還提供了治療具有任何上述紊亂的人 的方法，包括給予個(gè)體治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的制品。這樣的抗體制劑的劑量將隨要 治療的病癥和治療的接受者而改變，但例如可以對(duì)成人患者為每天或每周施用約50到約 2, OOOmg，優(yōu)選約100到約1，OOOmg，施用1到30天，并視需要重復(fù)。施用可以按單劑進(jìn)行， 或者分為多劑進(jìn)行。
[0126] 方法描述
[0127] 配制（formulation)步驟通常將例如經(jīng)過(guò)離子交換色譜得到的純化的總藥品 (drug substance)交換為最終的賦形劑組成和濃度。在該步驟中通常除了去除小分子以外 沒(méi)有發(fā)生純化。重點(diǎn)在于高產(chǎn)率、緩沖液交換、以及配制步驟的穩(wěn)健性（robustness)。在通 過(guò)TFF (切向流過(guò)濾）進(jìn)行配制的過(guò)程中，含有蛋白質(zhì)的進(jìn)料溶液在泵抽動(dòng)下通過(guò)膜系統(tǒng)并 回到循環(huán)（回流）容器中。TFF膜保留蛋白質(zhì)（作為截留液的一部分），而濾液（或滲透液 (permeate))在壓力的驅(qū)使下通過(guò)膜。該壓力稱為跨膜壓力（TMP)，通常用截留液壓力控制 閥控制該壓力。該方法通常通過(guò)第一超濾（濃縮），滲濾（恒定體積緩沖液交換）和第二超 濾（進(jìn)一步濃縮）的工序來(lái)實(shí)現(xiàn)。去除過(guò)程緩沖液組分所需的滲濾體積數(shù)（體積當(dāng)量）可 以容易地算出或通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定。
[0128] 抗-IgE通用的UF/DF方法
[0129] 用0. 5M磷酸水溶液將來(lái)自色譜的陰離子交換總物料的pH調(diào)節(jié)到pH約為6。通 過(guò)使用標(biāo)稱分子量截留為10, 〇〇〇 - 30, 000道爾頓的膜進(jìn)行本發(fā)明的超濾/滲濾（UF/DF) 過(guò)程，來(lái)對(duì)此經(jīng)過(guò)pH調(diào)節(jié)的陰離子交換總物料進(jìn)行配制。處理之前，用滲濾緩沖液（0.02M 組氨酸，0. 2M精氨酸-HCl，pH6)平衡UF膜。
[0130] 然后將來(lái)自陰離子交換的產(chǎn)物（陰離子交換總物料）加載于系統(tǒng)，通過(guò)第一超 濾濃縮到中間濃度。然后將總物料滲濾（8X或滲濾體積）到其配方（0.02M組氨酸，0.2M 精氨酸-HC1，pH6)。然后通過(guò)第二超濾將總物料濃縮到最終總體濃度>170g/L，然后通過(guò) 0· 22 μ m無(wú)菌濾器回收。整個(gè)UF/DF方法在約45°C的溫度設(shè)定點(diǎn)進(jìn)行。該溫度的控制是利 用進(jìn)料陰離子交換總物料及滲濾緩沖液的溫度控制，以及如本文所示用于UF/DF過(guò)程的帶 夾套回流容器來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
[0131] 進(jìn)行UF/DF后，將所得的總物料稀釋（即，調(diào)節(jié)（condition))到0· 02M組氨酸， 〇. 2M精氨酸-HC1，0. 04%聚山梨醇20, pH 6中約150g/L的總體濃度（最終配方）。在調(diào) 節(jié)步驟中，讓總物料的溫度回到環(huán)境溫度。調(diào)節(jié)后，再次通過(guò)0. 22微米無(wú)菌濾器回收配制 完的總物料。
[0132] UF/DF系統(tǒng)可以用0.1 N氫氧化鈉再生，并用I. 4%Minnc.are?消毒。不使用時(shí)， 系統(tǒng)可保存在〇. IN氫氧化鈉水溶液中。UF/DF膜在工作期（campaign)之間可保存在例如 〇· I % Roccal? /20 %甘油-水溶液中。
[0133] 通用超濾/滲濾方法步驟
[0134] 操作參數(shù)：進(jìn)料流速0. 5L/min/ft2。恒定截留液壓力（例如，IOpsig)控制用于清 洗和使用前平衡，而Cwall、恒定截留液壓力或恒定TMP用于處理。
[0135] 使用前平衡：使用前用經(jīng)過(guò)清洗的Pellicon-2膜包（cassette membranes)進(jìn)行 下列準(zhǔn)備，以確保膜被恰當(dāng)?shù)仄胶狻?br>[0136]
[0137]
[0138] 過(guò)程應(yīng)用：對(duì)于從先進(jìn)行的分離步驟例如Q-Sepharose色譜步驟獲得的初始陰離 子交換總物料（Q-p〇〇l)進(jìn)行下列步驟，：
[0139] 第一超濾（UFl)，達(dá)到從約5g/L到供滲濾的濃度（Cdf)
[0140] 滲濾（DFl)，四（4)個(gè)滲濾體積（DV)，使用DF緩沖液；
[0141] 繼續(xù)滲濾（DF2)，四（4)個(gè)滲濾體積（DV)，使用DF緩沖液；
[0142] 第二超濾（UF2)，達(dá)到最終濃度（Cfinal)，及
[0143] 可選的產(chǎn)品回收。
[0144] 上述步驟通常在低壓差循環(huán)下（混合）完成，例如15分鐘。
[0145] 使用后清洗：使用后，立即用下表所列的工序和條件清洗Pellicon-2膜包。
[0146]
[0147] TFF中操作模式的定義
[0148] 濾液開(kāi)放單通（Single Pass with Filtrate Open, SPF0)截留液和濾液都被導(dǎo)向 排出通道（drain)。濾液閥開(kāi)放。
[0149] 濾液開(kāi)放全循環(huán)（Total Recycle with Filtrate Open, TRFO)截留液和濾液都被 導(dǎo)向循環(huán)容器。濾液閥開(kāi)放。
[0150] 進(jìn)料分批超濾（FB-UF)。截留液被導(dǎo)向循環(huán)槽，濾液被導(dǎo)向排出通道，進(jìn)料的總物 料被輸送到循環(huán)槽中。
[0151] 分批超濾（B-UF)。截留液被導(dǎo)向循環(huán)槽，濾液被導(dǎo)向排出通道。
[0152] 滲濾（DF)截留液被導(dǎo)向循環(huán)槽，濾液導(dǎo)向排出通道。
[0153] dP指壓差。
[0154] 產(chǎn)物輸送.超濾膜單位和循環(huán)槽對(duì)總物料槽開(kāi)放?？刂频?dú)飧采w層的壓力。先使 用循環(huán)泵，再使用手工蠕動(dòng)泵來(lái)輸送總物料。
[0155] 進(jìn)料輸送.將進(jìn)料的總物料泵入循環(huán)槽。
[0156] 濾液封閉全循環(huán)（TRFC).截留液導(dǎo)向循環(huán)容器。濾液閥關(guān)閉。
[0157] "Q-總物料"（"Q-pool"）指由例如在先進(jìn)行的Q-S印harose色譜步驟得到、并已 用緩沖液調(diào)節(jié)過(guò)的蛋白質(zhì)總物料，又稱"調(diào)節(jié)過(guò)的總物料"。
[0158] WFI指注射用水。 實(shí)施例
[0159] 下面的實(shí)施例更加充分地描述上述公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)施方式，并提供本文公開(kāi)的多個(gè) 方面的最佳實(shí)施模式。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例不對(duì)本發(fā)明的真實(shí)范圍構(gòu)成任何限制，而是為 了示例目的而給出的。
[0160] 實(shí)施例1
[0161] rhuMAb E25的高濃度配制
[0162] 使用預(yù)試級(jí)（pilot scale) UF系統(tǒng)濃縮/配制rhuMAb E25 ( -種針對(duì)IgE的重組 人單克隆抗體，美國(guó)專利6, 172, 213)。組裝帶有5. 7平方英尺（sqft)、10, 000道爾頓再生 纖維素復(fù)合材料膜的Millipore Pelicon超濾/滲濾系統(tǒng)。該系統(tǒng)由膜固定器（membrane holder)、Waukeskaw 6型旋轉(zhuǎn)葉片進(jìn)料泵，1/2〃316L不銹鋼回流管道，以及回流容器組成。 壓力指示器/變送器（Anderson)位于膜固定器的入口（FEED)、出口（RETENTATE)和滲透 液口（FILTRATE)處。流量計(jì)（Yokogawa ADMAG)位于膜固定器的入口（FEED)和滲透液口 (FILTRATE)處。反壓調(diào)節(jié)閥（Mikroseal)設(shè)置在膜固定器的出口處，以控制截留液壓力并 產(chǎn)生跨膜壓力（TMP)?；亓魅萜魇褂?0升316L帶不銹鋼夾套的槽。該槽裝有液高指示器 (level indicator)、頂置攪拌器（top-mounted agitator) (Lightnin)、禍旋消除器及底閥 (NovAseptic)。利用充入槽夾套中的溫度受調(diào)節(jié)的乙二醇來(lái)控制溫度。
[0163] 本次運(yùn)行中，進(jìn)料流速設(shè)定為2. 85L/min(0. 5L/min/ft2)的恒定速率。在所有 的使用前和使用后操作中，截留液壓力控制設(shè)定為IOpsig的恒定值。超濾和滲濾中，系 統(tǒng)使用（^^控制模式來(lái)控制通過(guò)膜的通量，參見(jiàn)例如R. van Reis等，Constant Cwaii Ultrafiltration Process Control, J. of Membrane Science,130 (1997)，123-140。
[0164] 該過(guò)程之前，以單通一排出模式?jīng)_洗掉系統(tǒng)儲(chǔ)存溶液（0.1 N NaOH)，首先用2L/ft2的純化水（PW)，然后用lL/ft2的滲濾溶液（50mM組氨酸/pH6. 0)來(lái)沖洗。沖洗后，使0. 5L/ ft2的滲濾緩沖液回流IOmin來(lái)平衡系統(tǒng)。檢查回流的溶液的pH來(lái)確認(rèn)平衡。然后降低槽 中的液高到可測(cè)量的最小值，以最大地減少對(duì)進(jìn)料的蛋白質(zhì)總物料的稀釋。從在先進(jìn)行的 Q-Sepharose色譜步驟得到的蛋白質(zhì)總物料經(jīng)測(cè)定為3. 2g E25/L，體積為43. 1L。蛋白質(zhì)溶 于25mM Tris緩沖液及約200mM NaCl的溶液中，pH調(diào)節(jié)為6. 2。將蛋白質(zhì)總物料輸送到回 流容器中以開(kāi)始運(yùn)行。在該容器中通過(guò)頂置葉輪攪拌總物料，溫度保持于環(huán)境溫度（20 - 25〇C ) 〇
[0165] 在該過(guò)程中，總物料在UFl模式下被濃縮到50g E25/L (約2. 8L)。滲濾開(kāi)始時(shí)回 流容器的溫度設(shè)定點(diǎn)升高到40°C。溫度的升高和控制是通過(guò)使加溫的乙二醇流過(guò)槽的外夾 套實(shí)現(xiàn)的。然后用8個(gè)滲濾體積的滲濾緩沖液滲濾該總物料。滲濾在恒定體積下進(jìn)行，這 是通過(guò)使輸送到回流槽中的緩沖溶液的流速與從系統(tǒng)移出的濾液的流速一致而實(shí)現(xiàn)的。滲 濾結(jié)束后，進(jìn)一步在UF2模式下濃縮總物料。還使用升高的溫度設(shè)定點(diǎn)40°C進(jìn)行該階段。 該最終濃縮的目標(biāo)是ll〇g/L。無(wú)需降低進(jìn)料流速即實(shí)現(xiàn)了該目標(biāo)。然后，進(jìn)行低壓降混合 (low pressure drop mixing)，其中控制進(jìn)料泵以維持5 - IOpsig的跨進(jìn)料通道壓降。從 回流槽取樣，測(cè)得最終總體濃度為約120g/L。表1總結(jié)了 UF1，DF(DF1+DF2)，及UF2的處理 量（throughput)和通量結(jié)果。
[0166] 表 1
[0167]
[0168]
[0169] 圖2顯示，在該過(guò)程的不同階段或模式，包括UFl (10)，DF (20)和UF2 (30)中觀察 或測(cè)量的進(jìn)料流速（210)，槽溫（220)，進(jìn)料壓差（230)，TMP (240)和濾液流速（250)等參數(shù) 的經(jīng)時(shí)過(guò)程值。
[0170] 圖3顯示觀察或測(cè)量的E25濃度（310)，通量（320)和TMP (240)的經(jīng)時(shí)過(guò)程值。
[0171] 圖4顯示37°C條件下觀察或測(cè)量的UFl (410)和UF2 (420)壓力降對(duì)蛋白質(zhì)濃度的 經(jīng)時(shí)過(guò)程值。
[0172] 通過(guò)一系列步驟回收蛋白質(zhì)總物料。首先利用旋轉(zhuǎn)葉片進(jìn)料泵將回流槽中的蛋 白質(zhì)總物料從槽抽出并經(jīng)過(guò)Millipac 200, 0.22微米滅菌級(jí)濾器。然后，從截留液管線 (retentate line)上的最高點(diǎn)以5psig的氮?dú)膺M(jìn)行吹干（blow down)，從管道和膜單元排 出蛋白質(zhì)溶液。最后一個(gè)階段是吹干槽和進(jìn)料管線，同樣使用5psig的氮?dú)狻?br>[0173] 認(rèn)為產(chǎn)品收率與在環(huán)境溫度進(jìn)行的實(shí)施例1相比有改善，因?yàn)槌瑸V、滲濾或回收 步驟的一步或多步中所使用的提高的溫度降低了粘滯效應(yīng)。例如，當(dāng)產(chǎn)品回收過(guò)程中關(guān)閉 溫度控制時(shí)，系統(tǒng)在操作過(guò)程中緩慢冷卻，對(duì)從膜單元回收造成困難?；蛘撸梢韵葟哪す?定器進(jìn)行回收，再?gòu)幕亓鞑圻M(jìn)行回收。
[0174] 為了確定回收中損失的質(zhì)量，將1.74L DF緩沖液加入系統(tǒng)，回流約5分鐘，并用上 述同樣的工序回收。分析該回收的總物料和其它總物料的蛋白濃度。結(jié)果總結(jié)于表2。
[0175] 表 2
[0176]
[0177] 處理結(jié)束后，用0.1 N NaOH，lL/ft2單通沖洗，然后0. 5L/ft2全回流30min來(lái)再生 膜。然后用IlVft2PW(純化水）沖洗。然后用300ppm Minncare?全回流30min。用IL/ ft2PW再次沖洗系統(tǒng)，最后用0.1 N NaOH回流15min并儲(chǔ)存?；厥盏目偽锪舷♂尩?0g E25/ L并調(diào)節(jié)為50mM組氨酸/150mM海藻糖/0. 02%聚山梨醇（polysorbate)20/pH 6. 0的最終 配方。對(duì)進(jìn)料的Q-總物料和最終回收的總物料通過(guò)大小排阻色譜（SEC)分析產(chǎn)品質(zhì)量。數(shù) 據(jù)總結(jié)于表3。
[0178] 表 3
[0179]
[0180] 比較例2
[0181] 環(huán)境溫度條件下高濃度配制rhuMAb E25
[0182] 完成實(shí)施例1，但有下述的不同。該過(guò)程之前，以單通一排出模式?jīng)_洗掉系統(tǒng)儲(chǔ)存 溶液（0.1 N NaOH)，首先用2L/ft2的純化水（PW)，然后用lL/ft2的滲濾溶液（20mM組氨酸 /pH6.0)來(lái)沖洗。沖洗后，使0. 5L/ft2的滲濾緩沖液回流IOmin來(lái)平衡系統(tǒng)。檢查回流的 溶液的PH來(lái)確認(rèn)平衡。然后降低槽中的液高到可測(cè)量的最小值，以最大地減少對(duì)進(jìn)料的蛋 白質(zhì)總物料的稀釋。
[0183] 從在先進(jìn)行的Q-Sepharose色譜步驟得到的蛋白質(zhì)總物料經(jīng)測(cè)定為3. 3g E25/L， 體積為33. 3L。蛋白質(zhì)溶于25mM Tris緩沖液及約200mM NaCl的溶液中，pH調(diào)節(jié)為6. 2。將 蛋白質(zhì)總物料輸送到回流容器中以開(kāi)始運(yùn)行。在該容器中通過(guò)頂置葉輪攪拌總物料，溫度 保持于環(huán)境溫度（20 - 25°C )。在該過(guò)程中，總物料在UFl模式下被濃縮到50g E25/L (約 2. 2L)。然后用約8個(gè)滲濾體積的滲濾緩沖液滲濾該總物料。滲濾在恒定體積下進(jìn)行，這是 通過(guò)使輸送到回流槽中的緩沖溶液的流速與從系統(tǒng)移出的濾液的流速一致而實(shí)現(xiàn)的。還在 環(huán)境溫度進(jìn)行滲濾。滲濾結(jié)束后，進(jìn)一步在UF2模式下濃縮總物料。該最終濃縮的目標(biāo)是 ll〇g/L。但是，由于跨進(jìn)料通道的壓降高，未能達(dá)到該濃度。為了嘗試達(dá)到該濃度，進(jìn)料流速 降為I. 4L/min，總體濃度為80g E25/L，因?yàn)榭邕M(jìn)料通道的壓降達(dá)到了 50psig。UF2持續(xù)進(jìn) 行，直到再次達(dá)到50psig的高壓降，過(guò)程被停止。然后嘗試低壓降混合，利用進(jìn)料泵來(lái)維持 5psig的跨進(jìn)料通道壓降。但這也由于蛋白質(zhì)溶液的粘性而難以實(shí)現(xiàn)，因?yàn)樾D(zhuǎn)葉片泵達(dá)到 了過(guò)壓。從回流槽取樣，測(cè)得最終總體濃度為約104g/L。表4總結(jié)了 UF1，DF(DF1+DF2)，及 UF2階段的處理量和通量結(jié)果。
[0184] 表 4
[0185]
[0186] 圖5顯示，在該過(guò)程的不同階段或模式，包括UFl (10)，DF (20)和UF2 (30)中觀察 或測(cè)量的進(jìn)料流速（210)，槽溫（220)，進(jìn)料壓差（230)，TMP (240)和濾液流速（250)等參數(shù) 的經(jīng)時(shí)過(guò)程值。
[0187] 圖6顯示觀察或測(cè)量的E25濃度（310)，通量（320)和TMP (240)的經(jīng)時(shí)過(guò)程值。
[0188] 圖7顯示24°C條件下觀察或測(cè)量的UFl (410)和UF2 (420)壓力降對(duì)蛋白質(zhì)濃度的 經(jīng)時(shí)過(guò)程值。
[0189] 通過(guò)分步回收蛋白質(zhì)總物料。首先利用旋轉(zhuǎn)葉片進(jìn)料泵將回流槽中的蛋白質(zhì)總物 料從槽中抽出并經(jīng)過(guò)Millipac 200, 0.22微米滅菌級(jí)濾器。然后，從截留液管線上的最高 點(diǎn)處以5psig的氮?dú)膺M(jìn)行吹干，從管道和膜單元排出蛋白質(zhì)溶液。由于蛋白質(zhì)溶液的粘性， 這樣獲得的蛋白回收率很低。最后一個(gè)階段是吹干槽和進(jìn)料管線，同樣使用5psig的氮?dú)狻?br>[0190] 為了確定回收中損失的質(zhì)量，將1.85L DF緩沖液加入系統(tǒng)，回流約5分鐘，并用實(shí) 施例1的工序回收。分析回收的總物料和其它總物料的蛋白濃度。結(jié)果總結(jié)于表5。
[0191