調(diào)節(jié)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC)的免疫抑制活性或免疫刺激活性的新 穎方法。
[0002] 政府利益
[0003] 本發(fā)明是在來(lái)自國(guó)立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health)的基金 號(hào)為GM866889、DE014913和DE019932以及來(lái)自新澤西州科學(xué)技術(shù)委員會(huì)（New Jersey Commission on Science and Technology)的干細(xì)胞基金（NJCST-2042-014-84)的支持下 完成的。
【背景技術(shù)】
[0004] 細(xì)胞治療包括用于任何目的施用活細(xì)胞，包括任何病癥的診斷或者預(yù)防目的，例 如再生醫(yī)學(xué)、移植以及甚至是癌癥。據(jù)信，干細(xì)胞在細(xì)胞治療中具有巨大的潛力。但是，其 在臨床環(huán)境中有效的使用由于各種原因一直沒(méi)有清楚。
[0005] 干細(xì)胞具有兩個(gè)將它們區(qū)別于其他類型的細(xì)胞的明顯特征。第一，它們是非特化 的并且能夠長(zhǎng)期自我更新而在它們的一般性能上沒(méi)有顯著的改變。第二，在某些生理或者 實(shí)驗(yàn)條件下，干細(xì)胞可以被誘導(dǎo)分化成各種各種特化細(xì)胞類型。因此，干細(xì)胞對(duì)于再生醫(yī)學(xué) 大有希望。有兩種主要類型的干細(xì)胞：胚胎干（ES)細(xì)胞和成體干細(xì)胞。
[0006] 成體干細(xì)胞存在于很多成熟的組織中，例如存在于骨髓、肌肉、脂肪和大腦中。雖 然大多數(shù)成體干細(xì)胞研究集中于CD34+造血干細(xì)胞，但是，CD34-成纖維細(xì)胞樣間充質(zhì)干細(xì) 胞（MSC)的獨(dú)特譜系尤其是源自于骨髓的那些一直引起基礎(chǔ)和臨床研究者明顯注意（Chen 等?（2006) Immunol. Cell Biol. 84:413-421 ;Keating (2006) Curr.Opin.Hematol. 13: 419-425 ;Pommey&Galipeau(2006)Bull. Cancer 93 :901-907)。骨髓衍生的 MSC -直顯示 出分化為若干不同細(xì)胞類型的組織，例如軟骨、骨、肌肉和脂肪組織（Barry&M Urphy(2004) Int.J.Biochem. Cell Biol. 36:568-584 ;Le Blanc&Ringden(2006) Lancet 363: 1439-1441)。
[0007] 間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于再生醫(yī)學(xué)和自體免疫性疾病具有很大的潛力，并且在臨床試驗(yàn) 中已經(jīng)被評(píng)價(jià)為治療很多不同類型的疾病，包括肝纖維化、糖尿病、移植物抗宿主?。℅vHD) 和克羅恩病。MSC能夠有助于所移植的骨髓、分化自胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞、或者被誘導(dǎo)的多能 干（iPS)細(xì)胞的移植。因此，MSC的免疫抑制行為能夠在對(duì)抗這些病癥中提供有益的方法。
[0008] 從另一個(gè)角度看，免疫系統(tǒng)在對(duì)抗腫瘤形成和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。腫瘤總是 伴隨免疫抑制微環(huán)境。MSC具有特異性地轉(zhuǎn)移到腫瘤的固有能力，并且曾有提議作為腫瘤特 異性載體用于遞送抗腫瘤試劑。實(shí)際上，MSC已經(jīng)被遺傳改造為表達(dá)各種抗腫瘤因子，包括 I型干擾素、TRAIL、IL-12和LIGHT，并且已經(jīng)顯示出在動(dòng)物模型中具有強(qiáng)效的抗腫瘤作用。 因此，通過(guò)使用MSC引導(dǎo)刺激影響來(lái)增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)對(duì)于進(jìn)一步的癌癥治療來(lái)說(shuō)大有 希望。
[0009] MSC調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抑制或誘導(dǎo)的基本體內(nèi)機(jī)制遠(yuǎn)未清楚。更為重要的是，MSC的 臨床作用隨宿主的生理學(xué)和病理學(xué)狀態(tài)和MSC本身經(jīng)歷的微環(huán)境發(fā)生顯著的變化。因此， 存在在臨床環(huán)境中進(jìn)一步理解和開發(fā)出成功利用MSC的免疫調(diào)節(jié)作用的方案的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明描述了用于通過(guò)馴化MSC群抑制和誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法。本發(fā)明還提供了 使用基因修飾的MSC的免疫佐劑的新來(lái)源。
[0011] 對(duì)于治療應(yīng)用，本發(fā)明的藥物組合物能夠作為試劑盒提供。本發(fā)明的試劑盒含 有藥學(xué)可接受的載體；分離的間充質(zhì)干細(xì)胞群；分離的IFNy ;分離的IL-1 a ;1型干擾素 (IFN-I例如IFN-a、IFN-0 )、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子MTGF0 )、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF)、分離 的白介素-17A(IL17-A)和腫瘤壞死因子（TNF)。在另一個(gè)方面，所述試劑盒可以含有在用 于減弱免疫反應(yīng)和/或誘導(dǎo)或者加強(qiáng)免疫反應(yīng)的方法中使用所述試劑盒的說(shuō)明書。在又一 個(gè)實(shí)施方式中，所述試劑盒含有藥學(xué)可接受的載體、免疫抑制分子的抑制劑（例如N0合成 酶（iNOS)/吲哚胺_2,3_加雙氧酶（ID0)抑制劑）、用于加強(qiáng)或者抑制免疫反應(yīng)的其他細(xì)胞 因子或者治療制劑。
[0012] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，含有分離純化的MSC、IFN y和IL-17A的組合物被描述為與 藥學(xué)可接受的載體的混合物。本發(fā)明還提供了包含分離的MSC、IFN y、TNF a、IL-1和IL-17 與藥學(xué)可接受的載體的混合物的組合物。
[0013] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面，用于調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的方法被描述為通過(guò)向需要治療以抑 制或誘導(dǎo)受試者的免疫反應(yīng)的受試者施用有效量的含有分離的MSC的組合物來(lái)進(jìn)行，所述 MSC已經(jīng)使用IFNy以及細(xì)胞因子IL-1 a ;IFN-I、TGF0、FGF、TNFa或IL-17中的任何一 種以及它們的任意組合處理過(guò)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)施用有效量的含有分離的MSC 的組合物來(lái)增強(qiáng)（與沒(méi)有接受這種治療或者接受抗炎藥物（包括皮質(zhì)類固醇）或者非甾族 抗炎藥物以抑制免疫的受試者相比）受試者中的免疫抑制，所述MSC已經(jīng)使用IFNy以及 細(xì)胞因子IL-1 a、IL-1 0、TNFa或IL-17中的任何一種處理過(guò)。
[0014] 下文以實(shí)施例的形式描述優(yōu)選的方法和材料，所述實(shí)施例擬用于展示而非限制本 發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)與在此描述的那些方法和材料類似或者等效并且能夠用于實(shí) 踐或者檢測(cè)本發(fā)明的方法和材料。根據(jù)所詳細(xì)描述的說(shuō)明書以及權(quán)利要求書將明了本發(fā)明 的其他特征和優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1是顯示由MSC引起的免疫抑制被促炎細(xì)胞因子誘導(dǎo)的圖。向克隆得到的MSC 增補(bǔ)所示的重組細(xì)胞因子（各20ng/ml)的組合8小時(shí)，然后與CD4+T細(xì)胞母細(xì)胞（blast) 按1 : 20的比例（MSC : T細(xì)胞）共培養(yǎng)，再過(guò)8小時(shí)后進(jìn)行增殖評(píng)估。數(shù)值表示為采用 不同克隆的三個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表的五個(gè)孔的平均值土SD。*p < 0. 001。
[0016] 圖2是顯示iNOS-缺陷型MSC加強(qiáng)DTH的圖。C57BL/6小鼠使用在完全弗氏佐劑 中的0VA通過(guò)尾巴基部注射進(jìn)行免疫。小鼠在第7天使用200 y g聚合（aggregated) 0VA在 腳掌中進(jìn)行挑戰(zhàn)，所述OVA和或者不和野生型或者iNOS / MSC (2.5x10s細(xì)胞）一起施用。在 24小時(shí)后確定腳掌厚度增量作為DTH的度量。數(shù)據(jù)顯示為三個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表的平均值土SD。 *p < 0. 005,相對(duì)于單獨(dú)的0VA。
[0017] 圖3是顯示MSC以依賴于炎性細(xì)胞因子和NO的方式預(yù)防GvHD的圖。對(duì)受體小鼠 (C57BL/6xC3H，F(xiàn)l)進(jìn)行致死輻射并且使用C57BL/6骨髓細(xì)胞加上脾細(xì)胞進(jìn)行靜脈內(nèi)注射。 在骨髓移植后第3天和第7天，對(duì)受體施用所示的MSC。對(duì)于一些野生型MSC組，腹膜內(nèi)注 射L-NMMA、抗IFN y或抗TNF a、IL-1 a和IL-1 0的三抗體混合物（三抗體）。每天對(duì)存 活進(jìn)行監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)12周。
[0018] 圖4是顯示淋巴瘤基質(zhì)細(xì)胞（LSC)以N0依賴型方式促進(jìn)淋巴瘤形成的圖。355 個(gè)B-細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系（C3H-gld/gld背景，0. 5xl06細(xì)胞/小鼠）通過(guò)在第0天尾巴靜 脈與gld/gld小鼠衍生的淋巴瘤基質(zhì)細(xì)胞（C3H背景，P5,0. 25xl06細(xì)胞/小鼠）共注射。 1400W (N0S抑制劑，0. lmg/小鼠）通過(guò)在第0、2、4、8、12、16、20、24和28天進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。 當(dāng)小鼠頻臨死亡時(shí)記錄小鼠存活。
[0019] 圖5是顯示N0S抑制劑和IFNy的組合促進(jìn)小鼠黑素瘤治療的圖。B16-F0黑素 瘤細(xì)胞在第〇天通過(guò)靜脈內(nèi)注射到C57BL/6小鼠中（0. 5xl06細(xì)胞/小鼠）。在第4、8、12、 16、20天通過(guò)腹膜內(nèi)注射施用IFNy (250ng/小鼠）和1400W(N0S抑制劑，0? lmg/小鼠）。 在小鼠頻臨死亡時(shí)記錄小鼠存活。
[0020] 圖6 :IL-17A在mRNA和蛋白水平兩者上大大增強(qiáng)了小鼠BM-MSC中的炎性細(xì)胞因 子誘導(dǎo)性iNOS表達(dá)。BM-MSC使用所示細(xì)胞因子處理。iNOS基因表達(dá)通過(guò)實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行測(cè) 量。
[0021] 圖7 :IL-17A顯著地促進(jìn)了 MSC介導(dǎo)的免疫抑制作用。將MSC細(xì)胞和T細(xì) 胞雜交瘤Al. 1細(xì)胞系以1 : 20的比例共培養(yǎng)。向共培養(yǎng)物增補(bǔ)IFNy+TNFa或 IL-17A+IFN y +TNF a。細(xì)胞增殖通過(guò)〇. D. 570nm指示的細(xì)胞密度來(lái)量度。
[0022]圖 8 :IL-17A 預(yù)防了 iNOS mRNA 的衰減，（A) iNOS mRNA 穩(wěn)定性在 IFNy+TNFa 和 IFNy+TNFa +IL-17A治療組中放線菌素D治療后不同的時(shí)間點(diǎn)測(cè)量。⑶在IFNy和TNFa 治療后的不同時(shí)間點(diǎn)IL-17A的iNOS表達(dá)增強(qiáng)作用。
[0023]圖9:(A)克隆得到的MSC首先使用重組細(xì)胞因子IFNy、TNFa、IL-17A (各2ng/ ml)的所示組合處理12小時(shí)，然后與⑶4+T細(xì)胞母細(xì)胞按1 : 20比例（MSC : T細(xì)胞）共 培養(yǎng)，并且再過(guò)12小時(shí)后通過(guò)3H-胸腺啼啶引入法（incorporation)評(píng)價(jià)增殖。（B)MSC或 者Raw 264. 7 (巨噬細(xì)胞）中的IL-17受體家族成員的mRNA表達(dá)通過(guò)RT-PCR. NC :No RT進(jìn) 行檢查。（C) IL-17RA的表面表達(dá)通過(guò)免疫熒光或者流式細(xì)胞法在克隆得到的MSC中進(jìn)行檢 查。（D和E)MSC首先在使用或者不使用IL-17A(10ng/ml)的情況下使用IFNy和TNFa處 理。IFNy和TNF a以不同的細(xì)胞因子濃度增補(bǔ)12小時(shí)，然后與⑶4+T細(xì)胞母細(xì)胞⑶或 者T細(xì)胞雜交瘤Al. 1細(xì)胞（E)按1 : 20的比例共培養(yǎng)12小時(shí)。T細(xì)胞增殖通過(guò)3H-Tdr 引入法進(jìn)行測(cè)量。（F)MSC首先采用和梯度濃度的IL-17A-起的IFNy和TNFa (2ng/ml) 處理12小時(shí)，然后與T細(xì)胞雜交瘤Al. 1細(xì)胞按1 : 10的比例共培養(yǎng)12小時(shí)。T細(xì)胞增殖 通過(guò)3H-胸腺嘧啶引入法進(jìn)行測(cè)量。（G)MSC與新鮮的C57BL/6脾細(xì)胞加上抗⑶3、抗⑶28 和抗IL-17A的抗體按1 : 20或1 : 40的比例（MSC :脾細(xì)胞）共培養(yǎng)48小時(shí)，然后通過(guò) 3H-胸腺嘧啶引入法評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖。增殖數(shù)值表示為來(lái)自三個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表的三個(gè)孔的平均 值土 SEM。
[0024]圖10 :(A和C)MSC與炎性細(xì)胞因子IFNy、TNFa、IL_17A(10ng/ml)的不同組合 共培養(yǎng)12小時(shí)，然后收獲細(xì)胞進(jìn)行RNA提取。炎性分子iNOS、IL-6、CXCL1 (A)和趨化因子 CCL2、CCL5、CXCL9、CXCL10 (C)的mRNA表達(dá)水平通過(guò)定量RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)。（B)MSC與炎性 細(xì)胞因子IFNy、TNFa、IL-17A(10ng/ml)的不同組合共培養(yǎng)24小時(shí)，并且通過(guò)Western印 跡檢測(cè)iNOS的蛋白水平。（D)向MSC增補(bǔ)經(jīng)抗IL-17A的抗體預(yù)處理的Sup-CD3或Sup-CD3， 并且在12小時(shí)之后收集細(xì)胞進(jìn)行RNA提取。iNOS、IL-6、CXCL1、CCL2、CCL5、CXCL9和CXCL10 的表達(dá)通過(guò)定量RT-PCR進(jìn)行測(cè)量。Sup-⑶3 :來(lái)自被抗⑶3和抗⑶28激活的脾細(xì)胞的上清 液。（E)MSC使用經(jīng)抗IL-17A的抗體預(yù)處理的Sup-CD3或Sup-CD3進(jìn)行處理，并且在24小 時(shí)之后通過(guò)Western印跡評(píng)價(jià)iNOS的蛋白水平。mRNA表達(dá)數(shù)值為來(lái)自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代 表的三個(gè)孔的平均值土SEM。Western印跡數(shù)據(jù)來(lái)自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。
[0025] 圖11 :(A)Actl敲低的MSC或者對(duì)照使用IL-17A處理不同的時(shí)間，并且通過(guò) Western印跡評(píng)價(jià)IkB a、ERK、p65、JNK的磷酸化水平。（B)Actl敲低的MSC或者對(duì)照在用 或者不用IL-17A的情況下使用IFNy和TNFa處理（全部細(xì)胞因子以5ng/ml增補(bǔ)）。通 過(guò)Western印跡評(píng)價(jià)iNOS和Actl的蛋白水平。（C)MSC(Actl敲低或?qū)φ眨┦褂貌煌募?xì) 胞因子處理12小時(shí)，并且通過(guò)定量RT-PCR測(cè)量iNOS表達(dá)。mRNA表達(dá)數(shù)值為平均值土SEM。 (D)MSC(Actl敲低或者對(duì)照）首先在用或者不用IL-17A的情況下使用IFNy和TNFa處理 (全部細(xì)胞因子都以5ng/ml增補(bǔ)）12小時(shí)，然后與T細(xì)胞雜交瘤Al. 1細(xì)胞按1 : 10的比例 共培養(yǎng)12小時(shí)。T細(xì)胞增殖通過(guò)3H-Tdr引入法測(cè)量，以單獨(dú)Al. 1的增殖水平作為100%。
[0026] 圖12 :⑷WT MSC或者aufl 7 MSC使用IFNy和TNFa處理，或者使用IFNy和 TNFa與IL-17A-起進(jìn)行處理（全部細(xì)胞因子都以10ng/ml增補(bǔ)）12小時(shí)，并且iN0S、IL-6 和CXCL1表達(dá)通過(guò)定量RT-PCR測(cè)量。mRNA表達(dá)數(shù)值為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表的三個(gè)孔的平均 值土 SEM。⑶ WT MSC 使用 IFNy 和 TNFa (l〇ng/ml)處理，或者使用 IFNy 和 TNFa (l〇ng/ ml)與不同濃度的IL-17A-起進(jìn)行處理；aufl XMSC使用IFNy和TNFa (lOng/ml)處理， 或者使用IFNy和TNFa (l〇ng/ml)與l〇ng/ml的IL-17A-起處理。24小時(shí)之后，收獲細(xì) 胞用于通過(guò)Western印跡進(jìn)行iNOS檢測(cè)。Western印跡是三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。
[0027] 圖13 :(A和B)野生型（A)或aufl/MSC⑶在用或者不用IL-17A的情況下使 用IFNy和TNFa處理（所有細(xì)胞因子全部以l〇 ng/ml增補(bǔ)）6小時(shí)，然后添加放線菌素 D(5μg/ml)以終止轉(zhuǎn)錄。在所示的時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)定量RT-PCR分析mRNA水平，以添加放線菌 素D時(shí)的表達(dá)水平作為100%。mRNA表達(dá)數(shù)值為來(lái)自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表的三個(gè)孔的平均 值土 SD。
[0028] 圖14 : (A) WT MSC或auf 1 / MSC首先在使用或者不使用IL-17A的情況下使用 IFNy和TNFa處理（所有細(xì)胞因子全部以5ng/ml增補(bǔ)）12小時(shí)，并且然后與T細(xì)胞雜交瘤 Al. 1細(xì)胞按1 : 10的比例共培養(yǎng)12小時(shí)。T細(xì)胞增殖通過(guò)3H-Tdr引入法測(cè)量，以單獨(dú)的 Al. 1的增殖水平作為100%。（B)WT MSC或aufl XMSC首先在使用或者不使用IL-17A(10ng/ ml)的情況下使用IFNy和TNFa處理12小時(shí)，IFNy和TNFa以不同的細(xì)胞因子濃度增 補(bǔ)，并且然后與T細(xì)胞雜交瘤Al. 1細(xì)胞按1 : 10的比例共培養(yǎng)12小時(shí)。T細(xì)胞增殖通過(guò) 3H-Tdr引入法測(cè)量，以單獨(dú)的Al. 1的增殖水平作為100%。
[0029] 圖15:(A)測(cè)量ALT的血清水平（n = 3-5小鼠/組）。（B)肝組織中的單核細(xì)胞 (MNC)的絕對(duì)數(shù)量的計(jì)算。（C)⑶3+⑶4+和⑶3 +⑶8+T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量通過(guò)流式細(xì)胞法確 定。（D)施用ConA后8小時(shí)的肝切片的H&E染色。a.未處理小鼠；b. ConA+PBS ;c. ConA+ 野生型 MSC ;d. ConA+IFNy+TNFa 預(yù)處理野生型 MSC ;e. ConA+IFNy+TNFa +IL-17A 預(yù)處理野生型]\^(：4(：01^+31^1/]^(：出.(：01^+正~丫+了陬<1預(yù)處理 &1^1/]^(：; h. ConA+IFN y +TNF a +IL-17A 預(yù)處理 auf 1 7 MSCo
[0030] 圖16 :1型干擾素和FGF-2通過(guò)減弱NO的生成來(lái)下調(diào)MSC的免疫抑制作用。（A) 在沒(méi)有影響STAT1和NFkB途徑中的有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的情況下，I型IFN(IFNa )抑制MSC中 的IFNy+TNFa -誘導(dǎo)的iNOS蛋白表達(dá)。⑶增補(bǔ)I型IFN :IFNa或0令人驚訝地抑制了 MSC+脾細(xì)胞+抗⑶3體系中的MSC介導(dǎo)的免疫抑制。（C)FGF-2(FGFP)抑制了在MSC中受 IFNy+TNFa或IFNy+IL-10誘導(dǎo)的N0生成，這由培養(yǎng)物上清液中的硝酸鹽含量來(lái)反映。 (D)增補(bǔ)FGF-2顯著地降低了 MSC在MSC+脾細(xì)胞+抗⑶3體系中的免疫抑制作用。
[0031] 圖17 : (A)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC)中的可誘導(dǎo)性小鼠一氧化氮合成酶（iNOS)啟動(dòng)子 驅(qū)動(dòng)的人類吲哚胺2, 3雙加氧酶（ID0)表達(dá)體系的構(gòu)建。（A)質(zhì)粒構(gòu)建。（B) iNOS / MSC、空 載體-轉(zhuǎn)染的和人類ID0-轉(zhuǎn)染的iNOS/MSC使用（+)和不使用（-)重組小鼠炎性細(xì)胞因 子IFN y和TNF a刺激。人類ID0表達(dá)通過(guò)western印跡測(cè)量。
[0032] 圖18 :㈧為了確定轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞法分析GFP表達(dá)。（B) MSC-GFP和MSC-IFNa在5xl05/ml培養(yǎng)48小時(shí)。收集上清液并且通過(guò)IFNaElisa試 劑盒（PBL，NJ)測(cè)量IFNa濃度。（C)為了檢測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞釋放的IFNa是否具有任何 生物學(xué)功能，在使用APC-H-2Kb(ebi 〇SienCe，CA)染色后通過(guò)流式細(xì)胞法測(cè)定使用重組 IFNa (ebiosience，CA)或者 MSC-IFNa 和 MSC-IFNa 的上清液處理的 MSC-GFP、MSC_GFP 上的H-2Kb的表面表達(dá)。
[0033] 圖19 :⑷帶有或者沒(méi)帶有IX 106MSC_GFP或MSC-IFNa的IX 106B16腫瘤細(xì)胞 通過(guò)肌肉內(nèi)注射到C57BL/6小鼠中。12天后，切下腫瘤并稱重。（B)以如下不同數(shù)量的 MSC-IFNa 肌肉內(nèi)施用 IX 106B16 細(xì)胞：1X106(1 : 1)、1X105(1 : 10)、1X 104(1 : 100)、 IX 103(1 : 1000)、1X 102(1 : 10000)或者沒(méi)有 MSC-IFNa。12 天后，切下腫瘤并稱重。 (C)在帶有或者不帶有MSC-IFN a的1 X 106B16腫瘤細(xì)胞被通過(guò)肌肉內(nèi)注射到C57BL/6小 鼠中。在腫瘤接種后監(jiān)測(cè)小鼠存活，監(jiān)測(cè)1〇〇天。（D和E)通過(guò)肌肉內(nèi)注射將IX 106B16腫 瘤細(xì)胞注射到C57BL/6小鼠中。三天（D)或四天（E)后，通過(guò)肌肉內(nèi)接種1X10 6MSC-GFP或 MSC-IFNa。腫瘤接種12天后，切下腫瘤并稱重。（F)通過(guò)肌肉內(nèi)將IX 106B16腫瘤細(xì)胞接 種到C57BL/6小鼠中。三天后，通過(guò)肌肉內(nèi)注射PBS、5yg重組IFNa或lX10 6MSC_IFNa。 又過(guò)9天后，切下腫瘤并稱重。這些實(shí)驗(yàn)重復(fù)2至3次。誤差線、平均值土s.d.適用于所 有的圖。通過(guò)未配對(duì)的雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)（unpaired two-tailed Student^ s t test)評(píng)價(jià) 統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
[0034] 圖20 : (A) IX 106焚光素酶標(biāo)記的MSC-IFNa和1X10 6B16細(xì)胞一起被肌肉內(nèi)注 射到C57BL/6小鼠中。在注射后D0、D3、D7、D15和D21，通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)成像（live imaging) 檢測(cè)MSC。簡(jiǎn)而言之，將小鼠麻醉，并且在成像前將150mg/kg的D-熒光素（Caliper Lifescience，MA)腹膜內(nèi)提供給小鼠15分鐘。BLI數(shù)據(jù)使用Berthod NC100成像系統(tǒng)采 集。（B)計(jì)算并呈現(xiàn)熒光素酶信號(hào)強(qiáng)度（誤差線，平均值土s. d.)。（C)將帶有或者不帶有 1 X 106MSC_IFN a的1 X 106B16腫瘤細(xì)胞通過(guò)肌肉內(nèi)注射到C57BL/6小鼠中。12天后，收集 腫瘤。對(duì)于HE和Ki-67 (Abeam，MA)染色，將腫瘤樣品于10%福爾馬林中在室溫固定一周 并制備石蠟切片。對(duì)于TUNEL(原位末端標(biāo)記）分析，將腫瘤包埋在0CT中，立即冷凍并制 備切片以用于采用原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒（Roche，Basel，Switzerland)根據(jù)制造商的 程序進(jìn)行TUNEL分析。
[0035] 圖21 : (A)按1000 B16細(xì)胞/孔將其接種在96孔板的帶有Ong/ml、10ng/ml或 100ng/ml重組小鼠IFNa的每個(gè)孔中。三天后，使用lOyl CCK8(Dojindo, Shanghai， China)將細(xì)胞溫育2小時(shí)，并且測(cè)量0. D. (450nm)。（B和C)將有或者沒(méi)有1 X 106MSC-GFP 或MSC-IFNa的1X106B16腫瘤細(xì)胞通過(guò)肌肉內(nèi)注射到C57BL/6小鼠⑶或NOD-SCID(C) 小鼠中。十二天后，切下腫瘤并稱重。（D和E)將有l(wèi)X10 5、lX104MSC_IFNa或者沒(méi)有 MSC-IFNa的1 X 106B16腫瘤細(xì)胞通過(guò)肌肉內(nèi)注射到C57BL/6小鼠（D)或N0D-SCID小鼠 (E)中。十二天后，切下腫瘤并稱重。（F)將有或者沒(méi)有l(wèi)X10 4MSC_IFNa的1X106B16腫 瘤細(xì)胞注射到C57BL/6小鼠中。從腫瘤細(xì)胞接種前的一天開始每四天靜脈內(nèi)注射抗缺乏唾 液酸基的（asialo)GMl的NK細(xì)胞特異性耗竭性抗體（depletion antibody) (Wako, Osaka， Japan)或者媒介物對(duì)照。十二天后，切下腫瘤并稱重。（G)將有或者沒(méi)有IX 104MSC_IFNa 的1 X 106B16腫瘤細(xì)胞注射到C57BL/6小鼠或者0 2m缺陷型小鼠中。十二天后，切下腫瘤 并稱重。這些實(shí)驗(yàn)重復(fù)2至3次。誤差線、平均值適用于所有的圖。通過(guò)未配對(duì)的雙尾學(xué) 生 t 檢驗(yàn)（unpaired two-tailed Student' s t test)評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 除非另有說(shuō)明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域 的技術(shù)人員通常理解的相同含義，并且將被理解為具有下文描述的含義。本文提及的所有 出版物和專利在此通過(guò)引證的方式將它們?nèi)恳?。在沖突的情況下，將適用于包括定義 在內(nèi)的本說(shuō)明書。另外，材料、方法和實(shí)施例僅為闡述性的而無(wú)意是限定性的。
[0037] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"約"是指特定術(shù)語(yǔ)加上或者減去不超過(guò)5%。
[0038] 本文使用的詞語(yǔ)"主要由......組成"是指排除其他活性組分或者能夠?qū)M合 物、