與藥學可接受的載體的混合物。在另一個實施方式 中，本發(fā)明提供了這樣的組合物，該組合物包含分離的MSC群、分離的IFN y、分離的TNF a 和分離的IL-17A與藥學可接受的載體的混合物。在一個實施方式中，所述組合物還包含分 離的IL-1 a或0。所述試劑盒的使用方法提供用于在將有效量的MSC、分離的IFNy、分離 的IL-1 a、TNF a和分離的IL-17A施用于需要治療的受試者的步驟之后減弱免疫反應，由 此減弱受試者的免疫反應。
[0075] 本發(fā)明提供用于減弱免疫反應的方法，所述方法包括將有效量的分離的間充質干 細胞、分離的IFNy、分離的IL-1 a和分離的IL-17A施用于需要治療的受試者由此減弱該 受試者的免疫反應。在一個實施方式中，所述方法進一步包括分離的TNF-a。
[0076] 在另一個實施方式中，所述治療直接針對多發(fā)性硬化癥、關節(jié)炎、狼瘡、膿毒癥、肝 炎、肝硬化、帕金森氏病、慢性感染和移植物抗宿主疾病。在另一個實施方式中，所述MSC作 為藥物組合物提供，其中所述MSC在施用前與細胞因子混合物一起配制。在另一個實施方 式中，所述MSC和細胞因子作為單獨的組分施用。需要治療的受試者可以是患有與不利的 免疫反應相關的特定疾病或障礙的哺乳動物（例如人類、猴子、貓、狗、馬等）。在一個具體 的實施方式中，所述受試者是人類。
[0077] 有效性還可以通過監(jiān)測iNOS、ID0和/或細胞因子表達來確定。受益于減弱不利 的免疫反應的受試者包括患有或者易感自體免疫性障礙（例如類風濕性關節(jié)炎、1型糖尿 病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病、GvHD、肝硬化或銀肩病）、過敏癥（例如枯草熱）或膿毒癥的 受試者。另外，由于炎癥協(xié)調了腫瘤周圍的微環(huán)境，有助于增殖、存活和轉移，因此某些癌癥 患者還可以受益于本發(fā)明組合物。
[0078] 在器官移植和骨髓移植中，供體來源的T細胞能夠識別受體的MHC并且導致形成 GvHD。這通常致命的疾病往往是對各種免疫抑制治療沒有反應但是靶向免疫調節(jié)分子的 新方法在治療GvHD中顯示大有希望。最近，MSC已經顯示在臨床前試驗和臨床試驗中治療 GvHD時高度有效。本文提供的分析進一步證實，MSC活性借助于使用促炎細胞因子刺激后 的NO或IDO生成而被介導。因此，本發(fā)明的組合物可以用于器官移植或GvHD治療。
[0079] 體內確定合適的劑量可以使用本領域可接受的動物模型例如本文描述的DTH和 GvHD模型來完成。然而，由于本發(fā)明涉及在醫(yī)生或獸醫(yī)的關注下進行治療，因此可以在治療 過程中根據治療有效性的評價對治療的量和時間進行調節(jié)，這因受試者不同而異。另外，治 療可以根據醫(yī)生或獸醫(yī)的描述在患者中的免疫反應的特定階段提供。
[0080] 本發(fā)明還提供了用于增強癌癥的免疫治療的效力的方法，所述方法通過向接受免 疫療法治療的受試者施用有效量的N0S和/或ID0抑制劑。在一些具體的實施方式中，所 述抑制劑是ID0和iNOS選擇性抑制劑，例如本文所述的抑制劑。所述抑制劑的有效量是這 樣的量，其在使用免疫療法后與沒有接受所述抑制劑的受試者相比N0生成和/或ID0活性 的量降低至少50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或97 %。在一個具體的實施方式中，所述 方法提供了使用ID0和/或iNOS選擇性抑制劑增強干擾素治療（例如IFN y )的治療有效 性。
[0081] 本發(fā)明提供了用于在施用于患者中之前使用炎性細胞因子改變MSC的方法。該方 法將顯著地增強MSC在臨床環(huán)境中的效力。在至少一個方面，描述了 iNOS和細胞因子在 IFNy和另一種細胞因子作為必要物質（TNFa、IL-la或IL-1P中的任一種）共存的情 況下在MSC免疫抑制作用中的關鍵作用。在另一個方面，MSC已經顯示出在炎性細胞因子 IFNy和TNF a不足以誘導足夠的免疫抑制時轉變?yōu)榇龠M免疫反應。
[0082] 至少在一個實施方式中，描述了 IL-17A改變MSC和細胞因子之間的相互作用的動 力學的作用。本發(fā)明人已經發(fā)現(xiàn)，IL-17A增強了 MSC的免疫抑制功能，即使是在低劑量的炎 性細胞因子IFNy和TNFa存在的情況下。不像其促進免疫反應的傳統(tǒng)作用那樣，如本文 所述，IL-17A在MSC存在的情況下在免疫抑制中起到重要的作用。因此，在某些環(huán)境下，阻 斷IL-17A的活性可以誘導或者增強免疫反應。在至少一個實施方式中，描述了 IL-17A的 病理生理學作用。
[0083] IL-17A在促進炎癥和自體免疫性中是重要的。本領域技術人員能夠理解的是， IL-17A在增強MSC中的免疫抑制中的作用得到首次證實。過去，IL-17A已經被廣泛報道為 在IL-17A水平急劇上升的多發(fā)性自體免疫性疾病包括類風濕性關節(jié)炎（RA)、多發(fā)性硬化 癥（MS)和炎性腸?。↖BD)中加劇疾病進程。另外，疾病進程在IL-17A被遺傳消融或者施 用IL-17A阻斷抗體時減緩。
[0084] 然而，IL-17A不是總是促進免疫反應，因為過去報道提出，IL-17A在腸道炎性疾 病中具有保護功能。IL-17A的遺傳消融或者中和實際上能夠在葡聚糖硫酸鈉（DSS)誘導結 腸炎模型中加劇疾病進程。在這樣的背景下，本領域技術人員能夠理解的是，本發(fā)明的至少 一個方面提出了 IL-17A增強了 MSC的免疫抑制性能。在至少一個實施方式中，考慮了 MSC 在沒有IL-17A的情況下可能不會有效抑制免疫反應。
[0085] 在本發(fā)明的又一個方面，本發(fā)明人證實了 IL-17A通過新的細胞靶標間充質干細 胞在增強免疫抑制中的新功能。類似的，已經顯示IL-17A通過逆轉mRNA衰減因子AUF1造 成的基因表達的抑制作用而發(fā)揮這些作用。
[0086] 在本發(fā)明的至少一個實施方式中，小鼠中伴刀豆球蛋白（"ConA"）誘導的肝損傷 被用來研究自體免疫性或重癥病毒性肝炎的病理生理學過程，其中T細胞反應在調節(jié)肝損 傷中發(fā)揮關鍵的作用。由于T細胞反應的抑制能夠顯著地減弱ConA誘導的肝損傷，并且脂 肪組織衍生的基質細胞已經被證明減輕ConA誘導的肝損傷；本發(fā)明人使用骨髓衍生的MSC 并且研究IL-17A在調節(jié)MSC介導的肝損傷治療中的作用。因此，在本發(fā)明的至少一個方面 提出了 IL-17A能夠顯著增強MSC的免疫抑制作用。
[0087] 本發(fā)明進一步提出MSC僅能夠稍微影響ConA誘導的肝損傷的進程，因為MSC的免 疫抑制能力需要炎性細胞因子的刺激。雖然很多細胞因子能夠在體內施用ConA后生成，但 是這些細胞因子只能保持短時間的高水平，并且在后期施用時不能有效地刺激MSC。因此， 內在的MSC在減弱ConA誘導的肝損傷方面是無效的。
[0088] 因此，本發(fā)明的至少一個方面提供了 IL-17A通過新穎的細胞靶標間充質干細胞 增強免疫抑制的新且新穎的功能。本發(fā)明進一步設想IL-17A可以通過逆轉由mRNA衰減因 子AUF1導致的基因表達的抑制來發(fā)揮這些作用。如本文所述，IL-17A是用于增強MSC介 導的免疫抑制的因子。
[0089] 在某些情況中，本發(fā)明人已經發(fā)現(xiàn)需要體內和體外正向或者反向地控制免疫抑 制作用。在一個實施方式中，本發(fā)明人篩查了可以利用的生長因子和細胞因子并且發(fā)現(xiàn) 其中有兩個因子令人吃驚地調低MSC介導的免疫抑制：1型干擾素和成纖維細胞生長因子 (FGF-2)〇
[0090] I型干擾素（IFN)是導致宿主免疫力以根除病毒和其他細胞內感染的細胞因子家 族，而FGF-2(FGF-P，堿性成纖維細胞生長因子）屬于編碼具有生長、抗凋亡和分化活性的 肝素結合蛋白的基因家族。然而，沒有研究將這兩種細胞因子與免疫抑制的調節(jié)關聯(lián)起來。 I型干擾素和成纖維生長因子（FGF-2)起到通過調低iNOS表達的MSC介導的免疫抑制的負 調節(jié)子的作用。如本文所述，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這兩種細胞因子能夠潛在地抑制MSC轉向T細胞 增殖的免疫抑制作用（參見圖16)。進一步分析揭示，增補這些細胞因子中的任一種能夠令 人驚訝地減少iNOS蛋白的表達和N0的生成（圖17)。
[0091] 提供如下非限定性實施例來進一步闡述本發(fā)明。
[0092] 實施例
[0093] 實施例1
[0094] 材料與方法
[0095] 小鼠。6-8周齡的雄性C57BL/6、C3H/HeJCr和FI (C57BL/6xC3H)小鼠來自 National Cancer Institute (Frederick，Md.)。IFN y-Rl'小鼠和 iNOS z 小鼠來自 Jackson Laboratory(Bar Harbor，Me.)。小鼠被保持在 Robert Wood Johnson Medical School Vivarium。在每個實驗中，根據年齡和性別將動物匹配，所有實驗均得到Institutional Animal Care and Use Committee 的批準。
[0096] 試劑?？剐∈骉NF a、IL-1 a、IL-1 0和CCR5的重組小鼠IFN y和TNF a、 IL-1 a、IL-1 0單克隆抗體、FITC-偶聯(lián)抗小鼠⑶lib和PE-偶聯(lián)抗小鼠抗體F4/80來自 eBiosciences(La Jolla，Calif.)?？?IL-10 和 TGF-0 的抗體和重組小鼠M-CSF 來自 R&D Systems (Minneapolis，Minn.) 〇 抗 IFN y 來自 Harlan (Indianapolis，Ind.) 〇 抗 CXCR3 來 自 Invitrogen(Carlsbad，Calif.)。H引噪美辛、1-甲基-DL-色氨酸（1-MT)和 N G-單甲 基-L-精氨酸（L-NMMA)來自 Sigma-Aldrich(St. Louis，Mo.)。
[0097] 細胞。MSC生成于6至10周齡的小鼠的脛骨和股骨的骨髓。將細胞培養(yǎng)在a MEM 培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基增補有10%的FBS、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素 (全部來自Invitrogen)。在24小時之后移除非粘附細胞，并且保留粘附細胞，每三天重新 補充培養(yǎng)基。為了獲得MSC克隆，收獲融合細胞并且通過限制稀釋法將其接種在96孔板。 然后挑取單個克隆并擴繁。使用第5世代（passage)至第20世代的細胞。
[0098] T細胞母細胞使用⑶4 / T細胞亞組分離試劑盒（R&D Systems)通過負選擇法生成 于CD4+T細胞。細胞（lxlO6細胞/ml)采用塑料結合的抗CD3和可溶性抗CD28激活48小 時，然后單獨使用IL-2 (200U/ml)培養(yǎng)48小時。所有T細胞培養(yǎng)物保持在RPMI-1640培養(yǎng) 基中，該培養(yǎng)基增補有10%熱滅活？85、21111谷氨酰胺、1001]/1111青霉素、100 1^/1111鏈霉素和 50mM 0-ME (完全培養(yǎng)基）。
[0099] 從通過塑料結合的抗⑶3激活的脾細胞（2xl06/ml)的48小時培養(yǎng)物收獲激活的 脾細胞上清液，然后使用〇. 1 y m過濾器進行過濾并冷凍。
[0100] 細胞因子、趨化因子和N0的檢測。使用多路珠陣列試劑盒（multiplex bead array kit) (Invitrogen，Carlsbad，Calif.)利用液相晶片技術（Luminex Technology) (Bio-Plex System，Bio-Rad，Hercules，Calif.)分析培養(yǎng)物上清液的20個不同的細胞因子和趨化因 子。IFNy 米用 ELISA (BD Biosciences，San Jose，Calif.)分析。N0 使用改良 Griess 試 劑（Sigma-Aldrich)檢測。簡而言之，所有N03通過硝酸還原酶轉化為N02,并且總N02通 過 Griess 反應（Miranda 等.（2001) Nitric Oxide 5 :62_71)檢測。
[0101] 實時PCR。RNA使用RNEASY Mini Kit分離自細胞沉淀。第一鏈cDNA合成使 用SENSISCRIPT RT Kit用隨機六聚體引物進行（所有試劑盒均來自Qiagen，Valencia， Calif.)。感興趣的基因的 mRNA 通過實時 PCR(MX_4000 來自 Stratagene，La Jolla， Calif.)使用 SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，Calif.)進行 定量。mRNA的總量根據內源性肌動蛋白mRNA進行歸一化。iNOS的引物序列如下： 正向：5，-CAG CTG GGC TGT ACA AAC CTT-3' （SEQ ID N0:1);反向：5，-CAT TGG AAG TGA AGC GIT TCG-3' (SEQ ID NO :2)。其他引物來自 RT2 PROFILER. TM. PCR Array Mouse Chemokines&Receptors kit(Superarray，F(xiàn)rederick，Md. )〇
[0102] 趨化性分析。趨化性使用 NeuroProbe CHEM0TX Chemotaxis System (NeuroProbe， Gaithersburg，Md.)根據（Shi 等?（1993) J. Immunol. Meth. 164 :149-154)所述檢測。96-孔 板的下部分腔室用來自以IFNy加上TNFa (各20ng/ml，或Sup.CD3-act(l : 2稀釋液） 刺激的MSC的上清液填充。然后使用帶有5 ym孔的不含有聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸脂膜 覆蓋。T細胞母細胞（1. 25x. 105)被添加到上部分腔室。溫育3小時后，使用MTT分析（Shi 等.（1993) supra)對已經通過孔轉移并且進入底孔的細胞進行定量。將趨化性指數(shù)計算為 T細胞母細胞響應于MSC而轉移的數(shù)量與只是轉移到培養(yǎng)基的數(shù)量的比率。
[0103] 采用類似的設置（set-up)檢查由T細胞向炎性細胞因子激活MSC轉移導致的 免疫抑制。在使用或者不使用IFNy和TNFa (各20ng/ml)刺激24小時的情況下，將 MSC(2xl04)添加到下部分腔室。然后將激活的T細胞母細胞添加至上部分腔室中，如上所 述。將E-2添加至兩個腔室。3小時后，使用 3H-胸腺嘧啶對兩個腔室進行脈沖，并且在6 小時后評估細胞增殖。
[0104] MSC對GvHD的誘導和調節(jié)。對8周齡的C57BL/6xC3H F1小鼠進行致死輻射 (13Gy)并且在24小時后使用成核骨髓細胞（nucleated bone marrow cell) (5xl06)和從 C57BL/6親本小鼠分離得到的脾細胞（5xl06)通過尾巴靜脈注射進行輸注。在骨髓移植后 第三天和第七天，經由尾巴靜脈對受體施用來自C57BL/6野生型、IFNy R1 /或iNOS /小 鼠的0. 5xl06MSC。一些野生型MSC組還從第一次施用MSC后立即開始每天通過腹膜內注射 iNOS抑制劑、NG-單甲基L-精氨酸（L-NMMA，500 y g/小鼠）、抗IFN y (400 y g/小鼠）或 抗TNF a、IL-1 a和IL-1 0的三種抗體的混合物（各200 y g/小鼠），注射7天。作為陰 性對照，對F1小鼠注射F1骨髓細胞。每天觀察小鼠的GvHD病征（消瘦、折毛和駝背）并 在頻臨死亡時實施安樂死，于是標記存活時間。在第14天，收集各種組織并制備5 y m石蠟 切片且用蘇木精/署紅（H&E)染色。
[0105] DTH反應的誘導和組織學分析。通過尾巴基部注射用50 y 1完全弗氏佐劑乳化的 卵清蛋白（〇VA，10yg在50yl鹽水中）對C57BL/6小鼠（6-8周齡）進行免疫。5天后，通 過使用200 y g在30 y 1鹽水中的聚合0VA注射到右后腳掌進行挑戰(zhàn)來檢測DTH。左腳掌注 射30 y 1鹽水作為陰性對照。24小時后，使用游標卡尺測量抗原誘導的腳掌厚度增量并計 算如下：(Rimm-Limm)-(R. unimm-L. unimm)，其中R和L是右腳掌和左腳掌的厚度。
[0106] 統(tǒng)計學分析。通過未配對的雙尾學生t檢驗或方差分析（AN0VA)評價顯著性。
[0107] 實施例2
[0108] MSC的免疫抑制功能受到促炎細胞因子的誘導。
[0109] 為了鑒定潛在的機制，采用了小鼠MSC的克隆。這些克隆的干細胞特性由它們分 化成脂肪細胞或者成骨細胞的能力以及它們的表面標記物CD34 ;CDllb ;CDllc ;CD45 ;MHC class II;⑶44+;Sca-l+;MHC class Il°w的表達來限定。本文提供的所有結果使用至少三 個不同的MSC克隆重復。
[0110] 由于大部分報道的MSC引起的免疫抑制的研究都基于它們對T細胞增殖和細胞 因子生成的作用，因此首先檢查MSC對T細胞母細胞的IL-2驅動的增殖的影響。新鮮的 ⑶4 +T細胞母細胞通過使用抗⑶3激活然后使用IL-2擴繁若干天來由脾細胞生成（Devadas 等?（2006)Immunity 25 :237-247 ;Radvanyi 等?（1996)Cell Immunol. 170 :260-273)。T 細胞母細胞以1 : 20的比例（MSC : T細胞）和IL-2(200U/ml) -起添加。細胞增殖通過 3H-Tdr引入法在8小時之后進行評估。令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)這些T細胞母細胞的IL-2驅動 的增殖沒有受到MSC添加的影響。MSC對T雜交瘤Al. 1細胞的增殖也沒有影響。但是，這些 T細胞母細胞和T雜交瘤細胞沒有生成細胞因子，除非通過TCR重激活（Fotedar等.（1985) J. Immunol. 135 (5) :3028-33)。因此在沒有T細胞細胞因子的情況下，MSC不能抑制T細胞 增殖。
[0111] 為了檢查細胞因子誘導MSC的免疫抑制能力的可能性，通過在抗CD3存在的情況 下以梯度比例組合MSC和新鮮脾細胞來再現(xiàn)這些培養(yǎng)條件。這些分析的結果表明，當以低 至1 : 60(MSC :脾細胞）添加MSC時，T細胞增殖被完全阻斷。重要的是，為了施加它們的 免疫抑制作用，MSC不用必須是同系的（syngeneic)。使用第5至20世代之間的MSC，在純 化的由塑料結合抗⑶3抗體和抗⑶28激活的⑶4 +或⑶8 +T細胞上發(fā)現(xiàn)類似的作用。因此， 在T細胞激活過程中MSC和T細胞處在共培養(yǎng)物中的條件下，所得的T細胞反應受到MSC 的強烈抑制，表明T細胞生成的細胞因子可能具有作用。還檢查了從不同小鼠株系生成的 MSC克隆的免疫抑制能力。觀測到表現(xiàn)出更好的分化潛力的那些克隆具有較強的免疫抑制 能力。
[0112] 為了確定由激活T細胞分泌的細胞因子是否負責誘導由MSC引起的免疫抑制，使 用來自抗CD3激活的脾細胞的培養(yǎng)物的上清液增補MSC與T細胞母細胞（如上所述）的混 合共培養(yǎng)物。所得的T細胞增殖受到強烈抑制。還觀測到與MSC的共培養(yǎng)物中的Al. 1細 胞的增殖受到以激活脾細胞上清液進行的增補的抑制。這些實驗表明，誘導由MSC引起的 免疫抑制需要激活T細胞的一些產物。為了鑒定可歸責（culpable)的細胞因子，在添加至 共培養(yǎng)物之前，使用抗各種細胞因子的中和抗體處理激活脾細胞上清液。這些分析表明， IFNy的中和完全逆轉了與增補有抗CD3激活脾細胞上清液的MSC共培養(yǎng)的T細胞母細胞 的增殖的抑制。這些結果暗示在這個過程中IFNy作為關鍵的細胞因子，并且揭示在某些 條件下，這種主要促炎細胞因子反而能夠介導免疫抑制。
[0113] 然后通過向MSC+T細胞母細胞或MSC+A1. 1細胞的混合共培養(yǎng)物添加分離的重組 IFNy (20ng/ml)而不是添加激活脾細胞上清液來直接檢測IFNy的作用。令人驚訝的是， 單獨的IFN y沒有誘導免疫抑制。然后添加若干種其他促炎細胞因子（各20ng/ml)，并且發(fā) 現(xiàn)與IFNy -起同時添加TNFa、IL_1 a .或IL-1 0對于獲得與MSC的共培養(yǎng)物（MSC : T 細胞的1 : 20的比例）中的T細胞增殖的抑制是需要的（圖1)。因此，抗CD3激活脾細胞 上清液引起的MSC的免疫抑制功能的誘導可能是因為IFNy與TNFa ;IL_la ;或IL-1P協(xié) 同作用于MSC的緣故。因此，雖然IFNy是絕對需要的，但是單獨的該細胞因子是不足的； 在MSC中的適當?shù)拿庖咭种菩盘栟D導需要IFNy和其他三種細胞因子中的任意細胞因子的 協(xié)同作用。
[0114]在添加至MSC與T細胞母細胞的混合共培養(yǎng)物中之前，將抗TNFa、IL-la或 IL-1P的中和抗體單獨地或者一起添加至激活脾細胞上清液。雖然單獨的抗體沒有作 用，但是所有三種細胞因子的同時阻斷完全逆轉了 T細胞增殖的抑制。其他細胞因子例如 GM-CSF(粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子）和IL-6(白介素-6)沒有作用。本文的數(shù)據顯 示，IFN與其他三種促炎細胞因子TNFa、IL-la或IL-1P中的任意細胞因子的組合完全 負責誘導MSC抑制T細胞增殖的能力，并且TNF a、IL-I a和IL-I 0在與IFN y -起作用 中可以互換。
[0115] 設想MSC必定碰到源于初始T細胞激活的一定水平的IFN Y。實際上，發(fā)現(xiàn)在它們 的抗CD3誘導激活的過程中存在時，MSC沒有影響初始T細胞反應，如CD69表達中正常增 加所展示的那樣。作為在初始激活后由脾細胞釋放的IFNy對于誘導由MSC引起的免疫抑 制是關鍵的進一步證據，觀測到源自于IFNy受體1缺陷型小鼠（IFNy Rl-/_)的MSC不能 夠導致免疫抑制。衍生得到這些IFNy R1-/-MSC的若干克?。ㄋ械目寺《寄軌蚍只癁橹?肪細胞和成骨細胞樣細胞），受檢的五個克隆全部不能抑制抗CD3誘導的脾細胞增殖，這支 持了這樣的理解，即IFNy在MSC的免疫抑制功能的誘導中是必需的。
[0116] 這些結果表明緊靠MSC的細胞初始生成的IFNy和其他細胞因子對于誘導免疫抑 制能力是關鍵的。實際上，抗IFNy (20 y g/ml)在這種情況中也完全阻斷了 MSC的抑制作 用。另外，雖然單獨的抗TNFa、IL-la和IL-1P的抗體（各20 μg/ml)是無效的，但是當 將所有三種抗體一起添加時預防了免疫抑制，類似于它們在添加至激活脾細胞上清液時的 作用。因此，局部生成的IFNy和TNFa、IL-la和IL-1P的同時作用足以誘導MSC變成 具有免疫抑制性。
[0117] 實施例3
[0118] MSC引起的免疫抑制需要一氧化氮
[0119] 為