了鑒定由暴露于細胞因子的MSC引起的免疫抑制受到影響的機制，在各種設(shè)計 中檢查了在TRANSWELL系統(tǒng)中與MSC共培養(yǎng)的抗⑶3激活脾細胞（1 : 20，MSC :脾細胞） 的反應(yīng)。當(dāng)在孔的兩個腔室中采用滲透膜（〇.4ym孔膜）分開時，MSC對T細胞增殖幾乎沒 有作用，表明細胞膜關(guān)聯(lián)蛋白或其他局部作用因子對于由細胞因子初免的MSC引起的T細 胞增殖的抑制是關(guān)鍵的。雖然最近報道（Sato等.（2007) supra)顯示，PGE-2而不是ID0是 需要的，但是發(fā)現(xiàn)PGE-2并沒與參與。實際上，發(fā)現(xiàn)吲哚美辛（lOiiM，一種PGE-2阻斷劑）、 抗 IL-10(20 y g/ml)、抗 TGF0 (20 y g/ml)或 1-甲基-DL-色氨酸（1-MT，ImM，一種 ID0 抑 制劑）對由MSC引起的免疫抑制并沒有作用，由此排除了這些因子。
[0120] 已知高濃度的一氧化氮（N0)抑制T細胞反應(yīng)。N0從其來源快速擴散，但是活性 形式的濃度在約100 ym內(nèi)下降。因此，N0只能在緊密靠近生成它的細胞的位置作用，這與 介導(dǎo)由MSC引起的免疫抑制的因子的預(yù)期特性是吻合的。為了確定N0是否具有這種作用， 使用具有iNOS活性的選擇性抑制劑NG-單甲基-L-精氨酸（L-NMMA)關(guān)閉其生成。當(dāng)在抗 CD3存在的情況下添加至MSC與脾細胞的混合共培養(yǎng)物中時，L-NMMA完全恢復(fù)了正常的脾 細胞增殖。諸如1400W和L-NAME之類的其他iNOS抑制劑顯示出同樣的作用。而且，源自 于iNOS缺陷型小鼠（iNOS 〇的MSC對脾細胞增殖幾乎沒有作用。另外，在所衍生的五個 iNOS / MSC克?。ㄋ锌寺《寄軌蚍只芍炯毎统晒羌毎麡蛹毎┲?，沒有任何克隆是 免疫抑制性的。這些結(jié)果表明，MSC響應(yīng)于細胞因子誘導(dǎo)而生成的N0的活性介導(dǎo)了它們的 T細胞反應(yīng)的抑制。
[0121] 本文分析表明，由MSC引起的免疫抑制受到IFNy和促炎細胞因子的誘導(dǎo)并且通 過N0來介導(dǎo)。因此，設(shè)想到MSC在暴露于這些細胞因子之后能夠上調(diào)它們的iNOS表達并 且生成N0。為了對此進行檢查，使用激活脾細胞上清液處理MSC，通過實時PCR分析iNOS mRNA的水平，并與0 -肌動蛋白比較。這些分析的結(jié)果表明，iNOS在刺激后前4個小時在 MSC中得到顯著上調(diào)，高水平表達保持至少48小時。在刺激后12小時，iNOS mRNA的水平 比肌動蛋白信息強超過7倍，表現(xiàn)出極高的表達。當(dāng)將IFNy和TNFa (各20ng/ml) 一起添加時觀測到類似的作用，但是單獨任一種都是無效的。
[0122] 另外，IL-la和IL-10在這方面同樣可以與TNFa互換。當(dāng)添加抗體以中和抗 ⑶3激活脾細胞上清液中的細胞因子活性時，觀測到單獨的抗IFNy或者抗TNF a、IL-1 a 和IL-1 0的三抗體組合防止了由MSC引起的iNOS上調(diào)。當(dāng)單獨使用或雙重使用抗TNF a、 IL-1a或IL-1 0的抗體時，沒有作用。因此，誘導(dǎo)免疫抑制的相同細胞因子也是由MSC引 起的iNOS表達的強效誘導(dǎo)物。
[0123] 為了確定細胞因子處理的MSC中的iNOS表達是否確實導(dǎo)致N0生成，測量了來自 使用抗CD3激活的脾細胞上清液處理的MSC的條件培養(yǎng)基中的N0的兩個穩(wěn)定的分解產(chǎn)物 硝酸鹽（N03)和亞硝酸鹽（N02)。處理后由MSC生成的N02的量是來自經(jīng)過類似處理的 ⑶llb +F4/80+巨噬細胞的條件培養(yǎng)基中的N02的量的至少10倍，這已知是豐富的N0生成 物質(zhì)。這些結(jié)果與本文所述的高水平的iNOS mRNA表達相吻合。因此，MSC響應(yīng)于促炎細 胞因子而引起的iNOS表達上調(diào)導(dǎo)致N0的生成，其能夠作用于緊鄰的T細胞。
[0124] 在本研究中，使用T細胞激活或者當(dāng)添加外源性炎性細胞因子時，T細胞首先進入 細胞循環(huán)捕獲（cell cycle arrest)并且然后在24小時內(nèi)死亡。還觀察到這種凋亡依賴 于N0,因為當(dāng)使用iNOS抑制劑時沒有觀測到T細胞凋亡。當(dāng)使用iNOS /或IFN y Rl / MSC 時也沒有存在凋亡。因此，NO誘導(dǎo)的T細胞的細胞循環(huán)捕獲和凋亡是由炎性細胞因子激活 的MSC介導(dǎo)的免疫抑制機制的一部分。物種之間iNOS的炎性細胞因子誘導(dǎo)表達的差異已 經(jīng)在巨卩策細胞中被注意到（Schneemann&Schoedon. 2002)Nat. Immunol. 3(2) :102)。發(fā)現(xiàn)在 小鼠、大鼠和?？苿游飦碓吹木奘杉毎蠳O受到炎性細胞因子的誘導(dǎo)，但是在山羊、豬、兔 和人類巨卩策細胞中沒有被誘導(dǎo)（Schneemann&Schoedon (2002) supra ;Jungi 等?（1996) Vet. Immunol. Immunopathol. 54 :323-330)。因此，IDO和NO在由來自小鼠和人類的MSC引起 的T細胞增殖的抑制中的作用在并排比較中進行分析。發(fā)現(xiàn)由L-NMMA引起的NO抑制完全 逆轉(zhuǎn)了由小鼠MSC引起的免疫抑制，而由人類MSC引起的外周血單核細胞增殖的抑制受到 1-MT逆轉(zhuǎn)，表明與利用NO的小鼠MSC相比，來自人類的MSC利用ID0作為免疫抑制主要效 應(yīng)子（Ren G，Su J，Zhang L，Zhao X，Ling W，L' hui 1 lie A，Zhang J，Lu Y，Roberts AI， Ji W， Rabson AB， Shi Y.Species variation in the mechanisms of mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression. Stem Cells2009,27 :1954-1962)〇
[0125] 實施例4
[0126] MSC的趨化誘導(dǎo)性能受到促炎細胞因子的誘導(dǎo)
[0127] 在若干研究中，由MSC引起的有效體內(nèi)免疫抑制已經(jīng)采用少到1至5個MSC/10 6基 質(zhì)細胞來實現(xiàn)，并且經(jīng)常持續(xù)數(shù)月，在一些情況中實現(xiàn)免疫障礙的完全治愈?？紤]到MSC在 安置（settle)在組織中后是固定的，并且免疫抑制受到N0的介導(dǎo)，這僅僅非常局限地作用 于來源附近，這種免疫抑制作用是令人震驚的。設(shè)想到了細胞因子誘導(dǎo)的MSC可能具有誘 惑免疫細胞到其附近的機制，其中局部高濃度N0可能有效地作用于目標(biāo)T細胞。為了研究 這一點，在顯微鏡下隨時間監(jiān)測MSC和脾細胞的共培養(yǎng)物。
[0128] 在抗⑶3刺激后，觀測到脾細胞主動地向紡錘狀MSC迀移。相反，在沒有抗⑶3 刺激的情況下沒有發(fā)生迀移。由于脾細胞具有有限的活力，因此在沒有刺激的情況下缺少 向MSC的運動可能是因為這些細胞在體外健康欠佳。為了排除這一點，檢查了使用激活 的脾細胞上清液初免的MSC的誘惑Al. 1T雜交瘤細胞的能力，Al. 1T雜交瘤細胞甚至在沒 有IL-2的情況下也能夠很好地存活。在這些條件下，時間流逝顯微攝像法（time-lapse microvideography)揭示在共培養(yǎng)物啟動的1. 5小時內(nèi)T細胞向MSC活躍地迀移。然而，沒 有MSC初免的情況下，沒有T細胞向MSC的凈運動。因此，MSC只有在MSC暴露于促炎細胞 因子之后才會促進T細胞的迀移。
[0129] 為了檢查各種細胞因子在使MSC能夠誘惑T細胞中的作用，使用各種重組細胞因 子的組合對MSC進行預(yù)處理，并且觀測共培養(yǎng)物中所引起的被預(yù)激活T細胞的迀移。這個分 析表明已經(jīng)誘導(dǎo)MSC的免疫抑制功能的相同T細胞細胞因子對（即，IFN y和TNF a ;IFN y 和IL-1 a或IFN y和IL-1 0 )也導(dǎo)致它們誘惑T細胞。同樣的，使用特異性細胞因子的抗 體中和，發(fā)現(xiàn)向MSC迀移受到單獨的抗INF y的阻礙，或者被TNF a、IL-1 a和IL-1 0作為 三因子組的阻斷阻礙，這與它們對T細胞增殖的激活脾細胞上清液誘導(dǎo)的MSC抑制的作用 相同。因此，MSC的細胞因子誘導(dǎo)的免疫抑制功能很可能依賴于淋巴細胞迀移到MSC附近 N0水平最高的位置。
[0130] 實施例5
[0131] 促炎細胞因子誘導(dǎo)MSC生成對于免疫抑制具有關(guān)鍵作用的趨化因子
[0132] 激活T細胞向經(jīng)細胞因子初免的MSC穩(wěn)健迀移表明MSC分泌強效的化學(xué)引誘物 例如趨化因子。因此，通過分析上清液來確定在各種條件下培養(yǎng)的由MSC生成的白細胞 趨化因子。對于在沒有細胞因子的情況下單獨培養(yǎng)的MSC，沒有觀測到顯著的趨化因子生 成，證實了固有形式的MSC是不能誘惑T細胞的。但是，當(dāng)以1 : 60的MSC :脾細胞的比 例與抗CD3激活脾細胞共培養(yǎng)，MSC大量生成若干種趨化因子，包括1. 5ng/ml (在另一個 實驗中為12ng/ml)的CXCL-9(MIG)和50ng/ml的CXCL-IO(IP-IO)。這些是強效的T細 胞特異性趨化因子；已經(jīng)顯示濃度僅為1至l〇ng/ml的單獨的任意趨化因子驅(qū)動顯著的 體外趨化性（Loetscher 等?（1998) Eur. J. Immunol. 28 :3696_3705 ;Meyer 等.（2001)已111\ J. Immunol. 31 :2521-2527)。CXCL-9和CXCL-10的生成受到單獨的IFNy的抗體中和的抑 制或者受到所有三種細胞因子TNFa ;IL_la和IL-1P的抗體中和的抑制，這類似于對免 疫抑制誘導(dǎo)的作用。趨化因子生成類似地受到了將重組IFNy和TNFa (各20ng/ml)添加 到單獨的MSC的誘導(dǎo)，TNFa同樣地可以和IL-la和IL-10互換。因此，這些細胞因子足 以誘導(dǎo)趨化因子的MSC表達，這很可能負責(zé)將T細胞向MSC驅(qū)動的趨化性。因此，一旦它們 迀移到緊鄰MSC的位置，預(yù)期激活的T細胞將分泌誘導(dǎo)MSC生成額外趨化因子的細胞因子， 因此形成誘惑更多T細胞到MSC附近的正向反饋環(huán)路。
[0133] 為了系統(tǒng)性地檢查MSC的趨化因子表達曲線，檢查了使用來自天然的或者抗⑶3 激活的脾細胞的上清液處理的MSC中的編碼趨化因子和它們的受體的84種不同基因的表 達。使用小鼠趨化因子和受體RT2 PROFILER. TM.PCR Array試劑盒通過實時PCR分析總 RNA，并且將趨化因子mRNA水平與0肌動蛋白進行比較（表1)。一些人類細胞因子組合也 誘導(dǎo)了人類MSC中的類似的趨化因子生成。
[0134] 表1.在使用來自激活T細胞的上清液處理的MSC中的趨化因子和相關(guān)基因表達 的誘導(dǎo)（0-肌動蛋白被定義為1X10 7單位） 「01351
[0136]
[0137] 使用來自天然的或激活的T細胞的上清液（50%的終體積）刺激MCS (在5ml的完 全培養(yǎng)基中的lX106/T-25培養(yǎng)瓶（flask)) 12小時。通過實時PCR分析趨化因子和趨化因 子受體基因表達。
[0138] 發(fā)現(xiàn)除了低水平的CX3CL-1 (曲動蛋白（fractalkine))和CXCL13(趨化因子 (C-X-C)配體13，BCA-1)之外，暴露于天然的脾細胞上清液的MSC中的mRNA水平并不顯著。 令人吃驚的是，使用激活脾細胞上清液處理MSC導(dǎo)致一些趨化因子例如CXCL2 (趨化因子 (C-X-C)配體 2, Gro 0 )、CXCL5 (趨化因子（C-C)配體 5, RANTES)、CXCL9 (趨化因子（C-X-C) 配體9，MIG)、CXCL10 (趨化因子（C-X-C)配體10, IP-10)和CCL7 (趨化因子（C-C)配體7， MCP-3)增加了超過100萬倍。按絕對值計算，一些趨化因子達到甚至超過了與肌動蛋 白相同的表達水平。例如，CXCL10顯示出兩倍于肌動蛋白的mRNA拷貝數(shù)。受到最高度 誘導(dǎo)的趨化因子是白細胞趨化性的極其強效的誘導(dǎo)物，并且很可能在由MSC引起的免疫抑 制中發(fā)揮重要作用。實際上，觀測到CXCR3 (T細胞趨化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11的受 體（Lazzeri&Romagnani，(2005)Curr. Drug Targets Immune Endocr. Metabol. Disord. 5 ： 109-118)，它們在MSC中全部受到高度誘導(dǎo)）的抗體的抗體阻斷抑制了 T細胞母細胞趨向 MSC的趨向性并且逆轉(zhuǎn)了它們增殖的抑制。
[0139] 為了直接檢查促炎細胞因子誘導(dǎo)的MSC上清液的趨化性驅(qū)動能力，采用了 CHEM0TX趨化性系統(tǒng)（NeuroProbe)。該系統(tǒng)由被不含聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯膜（5 ym 孔尺寸）分隔開的上腔室和下腔室構(gòu)成。來自MSC培養(yǎng)物的上清液被放置到下腔室中并且 在IL-2存在的情況下將激活的⑶4 +或⑶8 +T細胞母細胞添加到上腔室中。在3小時之后 對趨化性進行定量。發(fā)現(xiàn)響應(yīng)于來自使用IFNy加上TNFa或者使用IFNy加上IL-1處 理的MSC的培養(yǎng)物上清液，CD4 +和CD8 +T細胞兩者均發(fā)生顯著的趨化性。使用來自被激活 的脾細胞調(diào)理的培養(yǎng)基處理的MSC的上清液也獲得類似的結(jié)果。
[0140] 相反，來自未處理的MSC或者激活的單獨的脾細胞的陰性對照上清液沒有趨化 性，如在沒有MSC的情況下直接添加IFNy加上TNFa的那樣。重要的是，這種趨化活性可 以被抗CXCR3和CCR5 (兩種最重要的T細胞特異性趨化因子受體）所阻斷，特別是在一起 添加這兩種抗體的情況下。除了募集T細胞之外，細胞因子激活的MSC還誘惑骨髓來源的 樹突細胞、巨噬細胞和B細胞。
[0141] CHEM0TX系統(tǒng)還被用來檢查趨化性在T細胞增殖的抑制中的作用。在該分析中， 在添加或者不添加IFNy加上TNFa的情況下，將MSC添加至下孔中，并且將T細胞母細胞 (和IL-2)添加至上孔中。在該設(shè)置中，在下孔中的MSC生成的趨化因子應(yīng)該誘導(dǎo)T細胞的 過膜迀移并且進入到下孔中，在下孔中，由MSC生成的N0因此能夠抑制它們的增殖。溫育 3小時后，使用3H-胸腺嘧啶對上孔和下孔再脈沖6小時，并且收獲兩個孔中的細胞以用于 確定增殖。⑶4 +和⑶8 +T細胞母細胞的增殖水平在IFNy和TNFa存在的情況下受到MSC 的顯著抑制。同樣地，抗T細胞趨化因子受體CXCR3和CCR5的阻斷抗體顯著地逆轉(zhuǎn)了這種 作用。這些數(shù)據(jù)進一步表明在MSC介導(dǎo)的免疫抑制中T細胞趨化性是關(guān)鍵的。
[0142] 總而言之，這些結(jié)果表明，當(dāng)MSC在免疫反應(yīng)過程中被暴露于促炎細胞因子時，它 們將生成大量的若干種趨化因子，特別是對T細胞具有特異性的那些趨化因子，因此，這些 趨化因子誘惑T細胞進入到緊鄰MSC的位置，在該位置處，高濃度的N0起到抑制T細胞功 能的作用。
[0143] 實施例6
[0144] MSC對遲發(fā)型超敏反應(yīng)（DTH)和移植物抗宿主?。℅vHD)的預(yù)防作用依賴于炎性細 胞因子和N0的生成
[0145] 單獨使用0VA或者使用0VA和來自iNOS缺陷型小鼠或野生型小鼠的MSC注射小 鼠的腳掌。然后使用0VA對小鼠的腳掌進行挑戰(zhàn)，并且根據(jù)腳掌腫脹測量所導(dǎo)致的DTH反 應(yīng)。這個分析的結(jié)果表明，施用野生型MSC導(dǎo)致DTH反應(yīng)中的炎癥減輕。明顯相反的是， iNOS缺陷型MSC不僅沒有減輕炎癥，而且實際上還增強了 DTH反應(yīng)（與沒有注射MSC的被 挑戰(zhàn)小鼠相比（圖2))。腳掌的組織學(xué)分析顯示來自被共注射野生型MSC的動物的皮膚中 的炎癥指示物減少，但是被共注射iNOS / MSC的那些小鼠在炎癥部位具有增加的流體和白 細胞侵潤。這個實驗不僅證明了免疫反應(yīng)抑制中需要N0,而且還顯示在沒有生成N0的情況 下，MSC介導(dǎo)的趨化性增強了炎癥并且可以被用來加強局部免疫反應(yīng)例如使用iNOS和ID0 的抑制劑促進疫苗的效力或者針對癌癥引起有效的免疫反應(yīng)。
[0146] 由MSC引起的免疫抑制的一種驚人作用是抑制移植物抗宿主?。℅vHD)的能力（Le Blanc 等.（2004)supra;Le Blanc&Ringden(2006)supra)。為了研究 MSC 引起的細胞因子 誘導(dǎo)的N0生成是否導(dǎo)致體內(nèi)的免疫抑制，將來自C57BL/6小鼠的5xl06的脾細胞和5x10 6 的有核骨髓細胞注射到經(jīng)致命輻射的FI (C57BL/6xC3H)小鼠以建立小鼠GvHD模型。所有 受體陽性對照小鼠在第15至22天之間都患上廣泛的GvHD(消瘦、折毛（ruffled hair)和 駝背）），而接受同系F1骨髓的陰性對照沒有受到影響。
[0147] 當(dāng)F1小鼠在骨髓移植后使用MSC(0. 5xl06來自于在第3和7天靜脈內(nèi)注射的供體 小鼠）處理時，對GvHD具有顯著的保護作用；所有MSC處理小鼠存活至少33天并且一些小 鼠存活超過75天。相反，使用源自于iNOS /或IFN y R1 /小鼠的MSC處理的F1小鼠沒有 受到保護，因為它們的存活與沒有受到處理的陽性對照沒有差異（圖3)。IFNy R1或iNOS 缺陷型的MSC沒有受到保護表明IFNy和NO生成對于MSC介導(dǎo)的體內(nèi)免疫抑制是必需的。
[0148] 由于體外結(jié)果顯示IFNy與三個細胞因子TNFa、IL_la，或IL-10之--起作用 以誘導(dǎo)MSC的免疫抑制功能，因此檢查了這些細胞因子在MSC介導(dǎo)GvHD保護中的作用。在 野生型MSC輸注后使用抗這些細胞因子的中和抗體或者L-NMMA注射小鼠7天，并且讓GvHD 發(fā)展?？笽FN Y和L-NMMA都導(dǎo)致MSC介導(dǎo)的GvHD保護的顯著逆轉(zhuǎn)（圖3)，而陰性對照小 鼠沒有顯示出響應(yīng)于這些處理的反作用。
[0149] 抗TNF a、IL-1a和IL-1 的三抗體混合物的作用沒有那么顯著，沒有達到統(tǒng)計 學(xué)顯著性（圖4)。該結(jié)果進一步暗示IFNY和N0生成，但是對于其他的細胞因子則是含糊 (equivocal)的。但是，重要的是，認識到除了與IFNy協(xié)同誘導(dǎo)由MSC引起的免疫抑制之 外，TNFa和IL-1在GvHD的正常致病機制中也是重要的因子。實際上，已經(jīng)有報道TNFa或 IL-1 的中和能夠降低 GvHD 的嚴重性（Hattori 等?（1998)Blood 91 :4051-4055 ;McCarthy 等.（1991)Bl〇〇d 78:1915-1918)。因此，多少預(yù)期GvHD保護沒有被這些抗體逆轉(zhuǎn)到更高 的程度。
[0150] 還在骨髓移植14天后檢查了來自這些小鼠的各種器官中的炎癥嚴重性的組織學(xué) 檢查。被觀測的白細胞侵潤的程度與存活結(jié)果具有良好相關(guān)性；GvHD誘導(dǎo)小鼠顯示肝、肺 和皮膚中的淋巴細胞數(shù)量增加，但是幾乎沒有出現(xiàn)在使用MSC處理的那些小鼠中。另外， MSC保護幾乎被抗IFN y和L-NMMA完全逆轉(zhuǎn)，而抗TNF a、IL-1 a和IL-11的三抗體混合 物作用較低?？偠灾?，來自這些GvHD實驗的發(fā)現(xiàn)以及來自DTH研究的那些發(fā)現(xiàn)清楚表明 IFN Y和N0在MSC介導(dǎo)的體內(nèi)免疫抑制中的作用。
[0151] 實施例7
[0152] 源自于腫瘤的MSC樣淋巴瘤基質(zhì)細胞具有免疫抑制性
[0153] 由于淋巴瘤中的腫瘤細胞沒有粘附，因此可以將p53+/_小鼠患有的淋巴瘤與腫 瘤基質(zhì)細胞分離。觀測到這些細胞可以進行體外繼代并且可以分化為脂肪細胞和成骨樣細 胞。令人感興趣的是，像源自于骨髓的MSC-樣，這些腫瘤基質(zhì)細胞也具有免疫抑制性，并 且能夠有效地抑制抗⑶3激活的脾細胞的增殖。這些免疫抑制作用也依賴于IFN y +TNF a 和N0,因為抗IFNy、IFNY和iNOS抑制劑能夠逆轉(zhuǎn)所述免疫抑制作用。
[0154] 實施例8
[0155] 淋巴瘤基質(zhì)細胞（LSC)以N0依賴方式促進了淋巴瘤的發(fā)展
[0156] 為了檢查淋巴瘤基質(zhì)細胞對腫瘤生長的影響，對355B-細胞淋巴瘤細胞系 (C3H-gld/gld背景，0. 5xl06細胞/小鼠）共注射源自于gld/gld小鼠的淋巴瘤基質(zhì)細胞 (C3H背景，P5,0.25xl0 6細胞/小鼠）。觀測到共注射基質(zhì)細胞顯著地增強了死亡率。令人 感興趣的是，施用1400W(N0S抑制劑，0. lmg/小鼠，在第0、2、4、8、12、16、20、24和28天）顯 著地逆轉(zhuǎn)了該作用（圖4)。因此，腫瘤基質(zhì)細胞能夠顯著地促進了腫瘤生長。
[0157] 實施例9
[0158] N0S抑制劑與IFNy的組合促進了小鼠黑素瘤治療
[0159] 為了檢驗?zāi)[瘤基質(zhì)細胞生成的N0對腫瘤免疫治療的作用，在第0天將B16-F0黑 素瘤細胞注射到C57BL/6小鼠中（0. 5xl06細胞/小鼠）。在第4、8、12、16、20天腹膜內(nèi)注 射施加IFNy (250ng/小鼠）或1400W(N0S抑制劑，0. lmg/小鼠）。當(dāng)小鼠頻臨死亡時記 錄小鼠存活。觀測到這種組合治療顯著地促進了小鼠存活（圖5)。因此，IFNy在腫瘤發(fā) 展中具有雙重作用；一是通過生成某些血管抑制因子或者阻斷某些血管形成因子生成來預(yù) 防腫瘤發(fā)展，另一個是通過生成因子如N0、ID0或PGE2利用腫瘤基質(zhì)細胞或其他環(huán)境細胞 誘導(dǎo)免疫抑制。因此，N0、ID0或PGE2中的一種或者多種的抑制能夠顯著地增強了癌癥治 療。因此，當(dāng)采用例如基于細胞因子、接種疫苗、抗體、樹突細胞或T細胞之類的免疫治療來 治療癌癥時，腫瘤基質(zhì)細胞可能負責(zé)大部分案例中使這些治療不能完全根除腫瘤。iNOS和 ID0的抑制劑與免疫治療的組合使用能夠提供了根除腫瘤的有效方法。
[0160] 實施例10
[0161] IL-17A與IFNY和TNFa協(xié)同誘導(dǎo)免疫抑制效應(yīng)子分子iNOS在小鼠骨髓間充質(zhì) 干細胞（BM-MSC)中的高表達
[0162] 小鼠MSC介導(dǎo)的免疫抑制依賴于炎性細胞因子。沒有這些細胞因子，MSC不會具 有免疫抑制作用，除非在炎性細胞因子IFNy與TNFa或IL-1存在的情況下，MSC才被刺 激以表達免疫抑制效應(yīng)子一氧化氮（N0)(其被可誘導(dǎo)性N0合成酶（iNOS)所催化）以及若 干種輔助分子-趨化因子和粘附分子。趨化因子和粘附分子將T細胞和其他免疫細胞保持 在MSC的附近，在此大量的N0抑制了免疫細胞的功能。
[0163] 由于體內(nèi)炎性環(huán)境除了我們前文提到的三種類型的細胞因子之外還含有各種類 型的炎性細胞因子和生長因子，因此帶有組織損傷的部位中的MSC的原位功能應(yīng)當(dāng)受到特 定微環(huán)境生態(tài)位中的各種細胞因子的影響，本發(fā)明人檢查了其他細胞因子特別是在自體免 疫性疾病和組織損傷中高水平表達的那些細胞因子。
[0164] 在被檢驗的若干種細胞因子中，發(fā)現(xiàn)IL-17A在IFNy和TNFa存在的情況下大大 增強了 iNOS表達。IL-17A是見于很多病理學(xué)癥狀中的關(guān)鍵促炎細胞因子，但是很少知道它 是如何影響MSC的生理學(xué)的。如圖6所示，在mRNA和蛋白水平上，IL-17A大大增強了 iNOS 的表達。這個發(fā)現(xiàn)表明進一步增補IL-17A可能是增