制劑或者結(jié)構(gòu)的基本特性產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性影響的任何其他組分，但是一般包括賦形劑。
[0039] 本文使用的術(shù)語"有效量"是指干細(xì)胞、細(xì)胞因子或者含有兩者的治療性組合物的 足以調(diào)節(jié)、減弱或者誘導(dǎo)受試者中的免疫反應(yīng)（即T細(xì)胞反應(yīng)的抑制或者免疫反應(yīng)的促進(jìn)） 由此減輕受治療的疾病或障礙的至少一種病征或癥狀的量。
[0040] 本文使用的術(shù)語"治療"、"處理"或類似術(shù)語是指通過向需要這種治療的患者施用 組合物來完成減輕疾病的病征或癥狀。這種減輕可以在疾病的病征或癥狀出現(xiàn)之前、以及 它們出現(xiàn)之后發(fā)生，因此所述術(shù)語包括預(yù)防性和活性治療。另外，"治療"不需要完全減輕 病征或癥狀或者治愈。在細(xì)胞水平上，所述術(shù)語可以包括發(fā)病的細(xì)胞群或目標(biāo)細(xì)胞群與未 處理的細(xì)胞或者使用對(duì)照或者比較試劑處理的細(xì)胞相比減少至少10%、25 %、50 %、75 %、 80%、85%、90%、95% 或 99%。
[0041] 本文使用的處在本發(fā)明的范圍內(nèi)的術(shù)語"施用"或者"治療方案"包括本發(fā)明的個(gè) 體組分中的任何組分或者其組合的單次治療輸送或者多次或者重復(fù)輸送，或者控制輸送治 療。這些術(shù)語進(jìn)一步意指包括輸送方式例如局部輸送、系統(tǒng)輸送、血管內(nèi)輸送、肌肉內(nèi)輸送、 腹膜內(nèi)輸送、腦血屏障內(nèi)輸送、器官特異性靜脈內(nèi)注射輸送或者經(jīng)由其他不同途徑輸送。
[0042] 一般來說，本發(fā)明描述了在預(yù)防和治療各種疾病例如多發(fā)性硬化癥、關(guān)節(jié)炎、狼 瘡、膿毒癥、肝炎、肝硬化、帕金森氏病、慢性感染和移植物抗宿主病（GvHD)以及甚至癌癥 和實(shí)體瘤中采用炎性細(xì)胞因子例如IL-la、白介素MIL-1P)、TNFa、IL-17A、IFN-I、 TGFP、FGF預(yù)處理MSC以增大它們的免疫調(diào)節(jié)作用例如免疫抑制或者免疫誘導(dǎo)作用的組合 物、方法和試劑盒。
[0043] 免疫抑制通過在免疫反應(yīng)過程中產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子引發(fā)。在沒有炎性細(xì)胞因子 的情況下，MSC沒有獲得它們的免疫抑制性能。本發(fā)明的至少一個(gè)方面描述了添加炎性細(xì) 胞因子從而初免（prime)并馴化（train)MSC以實(shí)現(xiàn)針對(duì)免疫反應(yīng)的強(qiáng)效且持久的抑制功 能。這種作用特別能夠由激活的T細(xì)胞的增殖或者其他免疫反應(yīng)參數(shù)包括激活的巨噬細(xì)胞 和其他免疫細(xì)胞、炎性細(xì)胞因子如IFNy或TNF a的血清水平表現(xiàn)。
[0044] 采用體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞因子對(duì)移植物抗宿主病（GvHD)實(shí)驗(yàn)性自體免疫性腦 脊髓炎、自體免疫性肝炎、慢性感染、肝硬化、肺硬化和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有關(guān)鍵的作用。在 本發(fā)明的至少一個(gè)方面，遺傳修飾的MSC被描述為能夠逆反地加強(qiáng)免疫反應(yīng)，這歸因于MSC 在沒有或者減少的N0或ID0的情況下分泌大量趨化因子和生長因子。因此，本發(fā)明提供了 強(qiáng)大的抑制性和增大性策略來控制免疫反應(yīng)。
[0045] 本發(fā)明的至少一個(gè)方面涉及經(jīng)初免或馴化的干細(xì)胞群，所述干細(xì)胞群通過如下方 法獲得：（i)從細(xì)胞來源獲得多能祖細(xì)胞；（ii)將所述多能細(xì)胞培養(yǎng)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中； (iii)將所述培養(yǎng)基中的間充質(zhì)干細(xì)胞與分化細(xì)胞分開；（iv)使用IFNy和有效量的至少 一種細(xì)胞因子激活至少一個(gè)亞組的所述經(jīng)分開的間充質(zhì)干細(xì)胞，所述至少一種細(xì)胞因子選 自由如下細(xì)胞因子組成的組：IL_la、IL_10、IL_17A、TGFa、FGF、IFN_I(IFNa、0)、TNFa 以及它們的任意組合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，通過這種方法產(chǎn)生的一個(gè)亞組的這些 馴化干細(xì)胞在施用于需要的受試者中時(shí)增強(qiáng)、加強(qiáng)、改善或誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。在至少一個(gè)實(shí)施 方式中，所述受試者是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選是人類、或者患有疾病的人類患者。在另一個(gè)實(shí)施方 式中，另一個(gè)亞組的馴化干細(xì)胞能夠抑制、減少、減弱感興趣部位的免疫反應(yīng)。
[0046] 本發(fā)明的至少一個(gè)方面是按照如下步驟進(jìn)行的制備經(jīng)初免或馴化的干細(xì)胞的方 法：（i)從細(xì)胞來源獲得多能祖細(xì)胞；（ii)將所述多能細(xì)胞培養(yǎng)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中；（iii) 將所述培養(yǎng)基中的間充質(zhì)干細(xì)胞與分化細(xì)胞分開；（iv)使用有效量的至少一種細(xì)胞因子 和IFNy激活至少一個(gè)亞組的所述經(jīng)分開的間充質(zhì)干細(xì)胞，所述至少一種細(xì)胞因子選自由 如下細(xì)胞因子組成的組：IL_la、IL-10、IL_17A、TGFa、FGF、IFN_I(IFNa、0)、TNFa 以 及它們的任意組合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法采用能夠?qū)崿F(xiàn)最優(yōu)的MSC性能 的特異性培養(yǎng)基。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括過濾或提取步驟，其中所有殘留的細(xì) 胞因子基本上與所生成的馴化干細(xì)胞分開。本文時(shí)用的馴化干細(xì)胞是指通過本文所述的方 法制得的干細(xì)胞，該干細(xì)胞可以由無性系的、非無性系的或者這兩種類型的干細(xì)胞組成。在 至少一個(gè)實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基是低氧的。
[0047] 在一個(gè)實(shí)施方式中，馴化干細(xì)胞亞組能夠抑制、減少或者減弱感興趣的部位處的 免疫反應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明描述了阻斷其他治療或生物學(xué)方案例如干擾素或 疫苗的免疫抑制性能的藥物試劑。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明描述了阻斷腫瘤相關(guān)MSC 的免疫抑制性能從而增強(qiáng)抵抗免疫抑制性疾病例如癌癥的免疫力的組合物。因此，MSC馴 化細(xì)胞能夠附屬于或被用于與其他標(biāo)準(zhǔn)腫瘤免疫治療程序結(jié)合以增加壓力下的免疫反應(yīng)。 這種免疫治療可以包括使用遺傳學(xué)、生物學(xué)和藥學(xué)修飾MSC、疫苗、蛋白或基因治療作為免 疫佐劑的疫苗和癌癥免疫療法。
[0048] 在本方面的另一個(gè)方面，用于刺激免疫反應(yīng)的方法被描述為在需要的受試者中根 據(jù)如下步驟進(jìn)行：(a)向所述受試者施用有效量的組合物，該組合物含有可誘導(dǎo)性一氧化 氮合成酶抑制劑、吲哚胺2,3_加雙氧酶抑制劑、可誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶（iNOS)-缺陷型 間充質(zhì)干細(xì)胞群、吲哚胺2,3_加雙氧酶（ID0)-缺陷型間充質(zhì)干細(xì)胞群或它們的任意組合； 和（b)抑制一氧化氮（NO)、吲哚胺2, 3-加雙氧酶或前列腺素E2(PGE2)中的一種或者多種 的生成。在一個(gè)實(shí)施方式中，
[0049] 本發(fā)明的至少另一個(gè)方面涉及組合物，該組合物包含：(a)分離的間充質(zhì)干細(xì)胞 群，所述分離的間充質(zhì)干細(xì)胞群通過包括如下步驟的方法生成：（i)從細(xì)胞來源獲得多能 祖細(xì)胞；（ii)將所述多能細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)基中以生成間充質(zhì)干細(xì)胞亞群和分化細(xì)胞亞群； (iii)將所述培養(yǎng)基中的間充質(zhì)干細(xì)胞與分化細(xì)胞分開；（iv)使用有效量的至少一種細(xì)胞 因子和IFNy激活至少一個(gè)亞組的所述經(jīng)分開的間充質(zhì)干細(xì)胞，所述至少一種細(xì)胞因子選 自由如下細(xì)胞因子組成的組：IL_la、IL_10、TGF0、FGF、IFN_I(IFNa、0)、TNFa以及它 們的任意組合；和可選的（b)藥學(xué)可接受的載體。在本發(fā)明的這個(gè)方面，所獲得的組合物誘 導(dǎo)接受該組合物的受試者的免疫反應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物可以基本不含有 在擴(kuò)繁（expand)階段期間使用的任何細(xì)胞因子。本文使用的術(shù)語基本上不含有是指以所 述組合物的重量計(jì)小于5重量％、4重量％、3重量％、2重量％、1重量％、0.5重量％、0.25 重量％或0. 1重量％。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群可以進(jìn)一步含有克隆的或者非克 隆的間充質(zhì)干細(xì)胞、分化細(xì)胞或者它們的混合物。
[0050] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，MSC的激活步驟通過將至少一個(gè)亞組的MSC呈遞給IFNy和 有效量的至少一種細(xì)胞因子足以引發(fā)所期望的免疫抑制性能的一段時(shí)間來完成，所述至少 一種細(xì)胞因子選自由如下細(xì)胞因子組成的組：IL_1 a、IL-1 0、IL-17A、TNFa以及它們的 任意組合。在該實(shí)施方式中，所獲得的組合物含有抑制或者減弱系統(tǒng)地或者局部地接受這 種組合物的受試者中的免疫反應(yīng)的分離MSC。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物基本不含有 任何殘留的細(xì)胞因子。在這個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物抑制局部免疫T細(xì)胞增殖。在另一 個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群可以進(jìn)一步含有克隆的或者非克隆的間充質(zhì)干細(xì)胞、分化細(xì)胞 或者甚至是它們的混合物，其中所述細(xì)胞群的至少50 %、60 %、70 %、75 %、80 %或90 %使 用克隆的MSC制得。
[0051] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明人描述了用于激活、增強(qiáng)、加強(qiáng)或誘導(dǎo)需要的患者 中的免疫反應(yīng)的方法，其中分離MSC群通過暴露于（a)分離的IFNy和（b)有效量的至少 一種細(xì)胞因子足夠的一段時(shí)間來進(jìn)行初免或馴化，所述至少一種細(xì)胞因子選自由如下細(xì)胞 因子組成的組：IL_1 a、IL-1 0、TGF0、FGF、IFN-I (IFNa、0 )、TNFa以及它們的任意組 合。本文使用的處在本發(fā)明的范圍內(nèi)的詞語"足夠的一段時(shí)間"包括馴化MSC以表現(xiàn)出期 望性能所需要的時(shí)間。所述一段時(shí)間范圍為至少1小時(shí)至約4周，包括12小時(shí)、24小時(shí)、36 小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)等等。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群可以進(jìn)一步含有克隆的或者 非克隆的間充質(zhì)干細(xì)胞、分化細(xì)胞或者甚至是它們的混合物，其中所述細(xì)胞群的至少50%、 60%、70%、75%、80%或90%使用克隆的]\^(：制得。
[0052] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，分離MSC群?jiǎn)为?dú)使用或者作為與分離的IFNy和/或其他 細(xì)胞因子的混合物施用。在至少另一個(gè)實(shí)施方式中，需要的患者可以是正患有自體免疫性 障礙、過敏癥、膿毒癥、肝硬化、癌癥、病毒性感染和器官移植中的任意一種。
[0053] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面，誘導(dǎo)免疫抑制的方法采用通過如下特殊方法獲得的馴化 間充質(zhì)干細(xì)胞群：（i)從細(xì)胞來源例如骨髓獲得多能祖細(xì)胞；（ii)將所述細(xì)胞包括分化細(xì) 胞和多能干細(xì)胞培養(yǎng)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中；（iii)將所述培養(yǎng)基中的間充質(zhì)干細(xì)胞與分化細(xì) 胞分開；（iv)通過將至少一個(gè)亞組的所述經(jīng)分開的間充質(zhì)干細(xì)胞暴露于IFNy和至少一種 細(xì)胞因子足夠的一段時(shí)間來激活所述至少一個(gè)亞組的所述經(jīng)分開的間充質(zhì)干細(xì)胞，所述至 少一種細(xì)胞因子選自由如下細(xì)胞因子組成的組：IL_la、IL-10、IL-17A和TNFa。在至 少一個(gè)實(shí)施方式中，用于激活所述間充質(zhì)干細(xì)胞的所述培養(yǎng)基不含有任何其他細(xì)胞因子來 源。
[0054] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，治療需要的所述受試者的方法包括將有效量的含有馴 化間充質(zhì)干細(xì)胞的組合物局部施用于患有需要治療的病癥的部位。
[0055] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及誘導(dǎo)N0合成酶（iNOS)、吲哚胺2, 3-加雙氧酶在至少一 個(gè)亞組的所述間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)的方法。在本發(fā)明的該方面，增加NO、ID0代謝物在治 療部位的濃度改善了臨床結(jié)果。
[0056] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面，MSC群被成功地轉(zhuǎn)導(dǎo)以釋放功能性IFN a。在至少一個(gè)實(shí) 施方式中，使用分泌IFN a的MSC的方法被描述為用于治療癌癥并控制腫瘤生長。
[0057] 在本發(fā)明的又一個(gè)方面，馴化干細(xì)胞群被描述為在治療試劑盒中用于臨床環(huán) 境。在至少一個(gè)實(shí)施方式中，所述治療試劑盒進(jìn)一步含有IFNy和至少一種細(xì)胞因子例如 IL-1 a、IL-1 0、IL-17A、IFN-I、TGF0、FGF、TNFa以及它們的任意組合。在一些具體的實(shí) 施方式中，治療試劑盒可以和適當(dāng)?shù)恼f明書一起組裝成準(zhǔn)備用于免疫抑制或者免疫增強(qiáng)從 而分別觸發(fā)這種免疫反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述試劑盒主要由馴化MSC、IFNy和至少 一種第二細(xì)胞因子組成，但是不含有將實(shí)質(zhì)性地改變所述馴化MSC的行為的任何其他活性 組分。
[0058] 在一個(gè)實(shí)施方式中，用于免疫抑制的治療試劑盒含有馴化干細(xì)胞群、IFN y和至少 一個(gè)細(xì)胞因子例如IL-1 a、IL-1 、IL_17A、TNFa和它們的任意組合。在另一個(gè)實(shí)施方式 中，用于免疫增強(qiáng)的所述治療試劑盒含有馴化的克隆干細(xì)胞群、IFNy和至少一個(gè)細(xì)胞因子 例如IL-la、IL-lf3、IFN_I、TGF、TNFa和它們的任意組合。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì) 胞因子為分離型。在另一個(gè)實(shí)施方式中，用于所述試劑盒的說明書說明用于觸發(fā)期望的臨 床結(jié)果的步驟。
[0059] 在又一個(gè)實(shí)施方式中，描述了用于刺激患有例如癌癥或病毒性感染的需要的患 者中的免疫反應(yīng)的方法。在該實(shí)施方式中，患者被施用有效量的組合物，所述組合物包含 可誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶抑制劑、吲哚胺2, 3-加雙氧酶抑制劑、可誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶 (iN0S)_缺陷型間充質(zhì)干細(xì)胞群、吲哚胺2, 3-加雙氧酶（ID0)-缺陷型間充質(zhì)干細(xì)胞群或 它們的任意組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法導(dǎo)致抑制一氧化氮（N0)、吲哚胺2， 3_加雙氧酶（ID0)或前列腺素E2 (PGE2)、1-MT、1400W、L-NMMA或其他合適的試劑中的一種 或者多種的生成。在該實(shí)施方式中，上述提及的iNOS或ID0的抑制劑單獨(dú)施用或者作為混 合物施用。在本發(fā)明的這個(gè)方面，所述患者的狀態(tài)是隨后接受免疫治療方案，包括包含本文 所述的馴化或者初免的MSC的方案的免疫治療方案，或者能夠包含使用所示干擾素、抗體、 細(xì)胞治療劑或調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的其他治療劑的另一種免疫治療方案。
[0060] 本發(fā)明的另一個(gè)方面描述了用于通過構(gòu)建表達(dá)人類ID0的小鼠iNOS缺陷型細(xì)胞 來篩查用于抑制或者增加哺乳動(dòng)物MSC包括人類或者小鼠MSC中的ID0活性的試劑或藥物 的方法，在所述表達(dá)人類IDO的小鼠iNOS缺陷型細(xì)胞中，IDO蛋白由受人類IDO基因在小鼠 iNOS啟動(dòng)子的控制之下編碼的氨基酸序列組成，由此改善了 MSC的免疫抑制功能。本發(fā)明 的這個(gè)方面描述了篩查試劑或藥物以增強(qiáng)或者抑制帶有人類ID0表達(dá)的小鼠模型中的ID0 活性的方法，人類ID0表達(dá)受小鼠iNOS啟動(dòng)子的控制，使得所述施用調(diào)節(jié)了 ID0活性，由此 治療疾病涉及癌癥或感染中ID0異常表達(dá)，尤其是在與免疫治療的組合的情況下。
[0061] 人類間充質(zhì)干細(xì)胞可以衍生自很多細(xì)胞來源，例如來自胎盤衍生物、來自骨髓，或 者從很多不同的來源獲得，包括股骨頭松質(zhì)骨塊的栓體（plug)、從患有退行性關(guān)節(jié)病的患 者的臀部或膝蓋置換手術(shù)過程中獲得，以及來自從正常供體和已經(jīng)收獲骨髓以備后期骨髓 移植使用的腫瘤患者獲得的抽取骨髓。雖然根據(jù)所收獲的骨髓的來源（即，骨片、外周血等 的存在），所收獲的骨髓通常被制備用于通過很多不同的機(jī)械分離方法進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)分 離，但是分離方法中涉及的關(guān)鍵步驟是使用專門制備的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有不僅允許間 充質(zhì)干細(xì)胞在沒有分化的情況下生長而且還允許只有間充質(zhì)干細(xì)胞直接粘附至培養(yǎng)皿的 塑料或玻璃表面區(qū)域的試劑。
[0062] 通過制備用于以很少的量存在于骨髓樣品中的期望的間充質(zhì)干細(xì)胞選擇性粘附 和存活的培養(yǎng)基，使存在于骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞與其他細(xì)胞（即，紅細(xì)胞和白細(xì)胞、成纖 維細(xì)胞、其他分化的間充質(zhì)細(xì)胞等）分開成為可能。人類MSC的其他來源包括臍帶、脂肪組 織和牙根。MSC是各種細(xì)胞類型的間充質(zhì)細(xì)胞系（包括骨、軟骨、脂肪、肌腱、神經(jīng)組織、成纖 維細(xì)胞和肌肉細(xì)胞）的多能祖細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞可以從例如骨髓、血液（包括外周血）、 骨膜和真皮以及具有中胚層起源的其他組織等組織分離和純化。在這個(gè)方面，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)雖 然這些祖細(xì)胞一般以非常少的量存在于例如骨髓中，并且這些量隨著年齡顯著下降（即， 從相對(duì)年輕的患者中的約1/10, 〇〇〇到年老患者的少至1/2, 000, 000)，但是當(dāng)培養(yǎng)在特異 性的培養(yǎng)基中時(shí)，利用人類間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)基底的選擇性附接（稱為"粘附"），人類間充質(zhì) 干細(xì)胞可以從各種組織中分離和純化。
[0063] 間充質(zhì)干細(xì)胞通常根據(jù)特定標(biāo)記物的表達(dá)或者表達(dá)缺失來識(shí)別。例如，MSC是 CD34-、CDllb、CDllc-、CD45-、MHC 類型 II、CD44+、Sca-1+、以及 MHC 類型 I 低。另外，MSC 可以通過它們分化成各種間質(zhì)細(xì)胞類型的能力來識(shí)別。體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明，培養(yǎng)條件、添加 劑、生長因子和細(xì)胞因子能夠精確地誘導(dǎo)MSC發(fā)育為所選擇的間質(zhì)細(xì)胞。例如，地塞米松和 異丁基甲基黃嘌呤或胰島素的組合或者異丁基甲基黃嘌呤、胰島素和吲哚美辛的混合物已 經(jīng)顯示出促使MSC分化為脂肪細(xì)胞。類似的，當(dāng)使用5-氮雜胞苷刺激時(shí)，MSC能夠分化為 骨骼肌肉細(xì)胞。已經(jīng)表明13-VGF導(dǎo)致間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞。
[0064] 雖然本發(fā)明不限于使用通過任何特定方法獲得的MSC，但是MSC可以通過本領(lǐng)域 可接受的任何方法從骨髓和臍帶分離，純化和擴(kuò)大培養(yǎng)。將骨髓細(xì)胞的栓體或抽吸物（由 優(yōu)勢(shì)量的紅細(xì)胞和白細(xì)胞以及非常少量的間充質(zhì)干細(xì)胞組成）通過注射器以將組織分離 成單個(gè)細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，多能祖細(xì)胞群從適合的來源例如骨髓、臍帶或脂 肪組織獲得，進(jìn)一步在通常含有谷氨酰胺的適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)和擴(kuò)繁。然后識(shí)別間充質(zhì)干 細(xì)胞并且與分化細(xì)胞區(qū)分開，并且進(jìn)一步在含有IFNy和選自由IL-1 a、IL-1 0、IL-17A、 IFN-I、TGF、FGF、TNFa組成的組的至少一種細(xì)胞因子或者它們的任意組合的培養(yǎng)基中擴(kuò) 繁。在另一個(gè)實(shí)施方式中，識(shí)別無性系的間充質(zhì)干細(xì)胞并且將其與分化細(xì)胞區(qū)分開，并且進(jìn) 一步在含有正1^和選自由11-1€[、11-10、11-174、正^1、了6?、？6?、了陬€[組成的組的至 少一種細(xì)胞因子或者它們的任意組合的培養(yǎng)基中擴(kuò)繁。在任一情況中，在這種培養(yǎng)基中擴(kuò) 繁的所述間充質(zhì)干細(xì)胞被馴化和程序化從而抑制或增強(qiáng)特定臨床環(huán)境中的免疫反應(yīng)。
[0065] 在一個(gè)實(shí)施方式中，將所述多能祖細(xì)胞培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基例如完全培養(yǎng)基（例 如含有10%的胎牛血清的MEM培養(yǎng)基）和濕潤的氣氛（優(yōu)選低氧）中。所述培養(yǎng)基保持不 變至少一天以允許細(xì)胞粘附至培養(yǎng)皿。隨后，每3至4天更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)所述細(xì)胞生 長至融合時(shí)，將所述細(xì)胞從培養(yǎng)皿上脫離，優(yōu)選使用胰蛋白酶進(jìn)行。在移除或滅活所述胰蛋 白酶之后，可以將細(xì)胞于不含有血清的培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)。用于分離和培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞 的另外方法在美國專利申請(qǐng)No. 20070160583和No. 20070128722中提供，在此通過引證的 方式將它們整體引入。MSC還可以使用類似的方法從臍帶的渥頓氏胨（Wharton' s jelly) 中分離。
[0066] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明分離的間充質(zhì)干細(xì)胞可以是一個(gè)亞組的異源性細(xì)胞 群，包括某些分化細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的間充質(zhì)干細(xì)胞是僅含有馴化的無 性系MSC的同源性組合物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述MSC可以是富含MSC的混合細(xì)胞群。 在這個(gè)方面，分離的MSC細(xì)胞群由至少約75 %的MSC組成，或者由至少約83 %、84 %、88 %、 89%、90%、91%、93%、95%、96%、97%或98%的克隆1^(：組成，同時(shí)余下的可以包括分化 細(xì)胞、祖細(xì)胞、血細(xì)胞、或者將增強(qiáng)臨床結(jié)果的任何其他合適的細(xì)胞。
[0067] 有效量是指MSC和細(xì)胞因子的足以減弱受試者中的免疫反應(yīng)（即，T細(xì)胞反應(yīng)的 抑制）由此減輕疾病或者障礙的至少一個(gè)病征或癥狀的量。
[0068] 根據(jù)本發(fā)明使用的所述間充質(zhì)干細(xì)胞按照優(yōu)先級(jí)為自體同源的、同種異體的或異 種異體的，并且選擇可以主要依賴于治療需要的緊急程度。
[0069]本發(fā)明的細(xì)胞因子可以通過常規(guī)純化方法、通過重組技術(shù)或者從商業(yè)來源獲 得。例如，干擾素Y (IFN丫）的氨基酸序列以GENBANK登錄號(hào)NP 000610(人類）和 NP 032363(小鼠）提供。IFN蛋白的商業(yè)來源包括例如INTERMUNE(Brisbane，Calif.) 和？6口1~〇16(：11，111(3.(1?0〇1^11；[11，11]\)。類似地，腫瘤壞死因子-(1(了即(1、惡病質(zhì) 素（cachexin)或惡液質(zhì)素（cachectin))以 GENBANK 登錄號(hào) NP 000585 (人類）和 NP 038721 (小鼠）提供，并且可以從諸如 ProSpec Bio (rehovot，Israel)和 PeproTech，Inc. 等來源商購獲得。類似地，人類白介素1-a (ILla)和白介素1-0 (IL1P)的登錄號(hào)已知 分別為P01583和P01584,并且可以從諸如ProSpec Bio和P印roTech，Inc.等商業(yè)來源獲 得。白介素17A(IL17A)的登錄號(hào)已知為BC067505(人類）和NM 010552(小鼠）。當(dāng)根據(jù) 本發(fā)明使用時(shí)，細(xì)胞因子是"分離的"，即同源的（100%)或接近同源的（90%至99%)。在 一個(gè)具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞因子是重組蛋白。
[0070] 白介素17A是關(guān)鍵的炎性細(xì)胞因子之一，主要由產(chǎn)生IL-17的⑶4 +T細(xì)胞（Thl7) 細(xì)胞產(chǎn)生，其因?yàn)樵谘仔院妥泽w免疫性反應(yīng)中的促炎功能而成為眾所周知的細(xì)胞因子。 IL-17A通過異聚體受體復(fù)合物IL-17RA和IL-17RC進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。一旦IL-17A結(jié)合， IL17RA便募集Act 1，IL-17A誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的一種關(guān)鍵下游調(diào)節(jié)子。雖然關(guān)于 IL-17A誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和IL-17A在炎性和自體免疫性疾病中的作用已經(jīng)知道不少， 但是其細(xì)胞靶標(biāo)和作用方式仍然不懂。
[0071] 本發(fā)明單獨(dú)采用IL-17A或者采用IL-17A與其他細(xì)胞因子組合使用來促進(jìn)導(dǎo)致免 疫抑制的馴化MSC。上述的MSC和細(xì)胞因子可以為組合物的形式，例如為適合施用于需要使 用它們進(jìn)行治療的受試者的藥物組合物的形式。本發(fā)明的組合物可以通過任何常規(guī)的方法 施用，包括腸胃外（例如皮下或者肌肉內(nèi)）或者靜脈內(nèi)注射、靜脈內(nèi)灌注、特異性器官介入 或者局部應(yīng)用。所述治療可以由在一段時(shí)間內(nèi)的單劑量或者多劑量組成。
[0072] 藥物組合物通常含有至少一種可接受的載體。所述載體必須是在與MSC和細(xì)胞因 子具有相容性并且對(duì)其受體無害的意義上是"可接受的"。通常，所述載體可以是合適的等 滲溶液例如磷酸緩沖鹽水、培養(yǎng)基例如DMEM、含有或者不含有白蛋白的生理鹽水、5 %的右 旋葡萄糖水溶液和/或它們的混合物，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他合適的液體。
[0073] 在用于治療用途的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的所述藥物組合物還可以作為 試劑盒提供。本發(fā)明的試劑盒可以僅含有藥學(xué)可接受的載體；使用分離的IFNy、分離的 IL-1 a刺激或馴化的分離間充質(zhì)干細(xì)胞群；和分離的IL17A和用于在減弱免疫反應(yīng)的方法 中使用所述試劑盒的進(jìn)一步的說明書。在本發(fā)明的這個(gè)方面，可以施用以所述試劑盒的細(xì) 胞因子組分刺激的細(xì)胞。所述試劑盒還可以可選地包括例如通過注射施用所述細(xì)胞的裝 置。在一個(gè)可選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的適合用于腸胃外施用的組合物可以進(jìn)一步包含抗 氧化劑與一種或者多種藥學(xué)可接受的無菌等滲水性或非水性溶液、懸浮液或無菌凍干形式 的粉末的組合，所述無菌凍干形式的粉末可以僅在使用之前重構(gòu)成無菌可注射溶液或者分 散液，其可以含有抗氧化劑、礦物質(zhì)和維生素、緩沖劑、使最終制劑成為等滲的溶質(zhì)的組合。
[0074] 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種組合物，該組合物包含分離的克隆MSC群、分離的IFN Y、 分離的IL-la或0以及分離的IL-17A