強(qiáng)MSC的免疫抑制活性的有潛力的策 略。
[0165] 實(shí)施例11
[0166] IL-17A增強(qiáng)了 BM-MSC介導(dǎo)的對(duì)T細(xì)胞增殖的免疫抑制
[0167] 為了檢驗(yàn)IL-17A增強(qiáng)iNOS表達(dá)是否具有功能性，進(jìn)行MSC-T細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)以 評(píng)價(jià)MSC的免疫抑制活性。如圖7所示，增補(bǔ)IFNy和TNFa可以以細(xì)胞因子濃度依賴形 式降低T細(xì)胞增殖。令人吃驚的是，添加IL-17A增強(qiáng)了 MSC對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制。因此， IL-17A在增強(qiáng)MSC介導(dǎo)的免疫抑制中是功能性的。
[0168] 實(shí)施例12
[0169] 材料與方法
[0170] 試劑和小鼠
[0171]重組小鼠 IFNy、TNFa、IL_17A和抗 IL-17A抗體來(lái)自于 eBiosciences(La Jolla， CA)。重組小鼠 IL-2 來(lái)自 R&D Systems(Minneapolis，MN)。抗 肌動(dòng)蛋白、GAPDH、iN0S、 p-IicBa、p-P65、p-JNK 和 p-ERKl/2 的抗體來(lái)白于Cell Signaling Technology(Danvers， MA)。抗 Actl 的抗體來(lái)自于 Santa Cruz Biotechnology(Dallas，TX)。PMSF 和放線菌素 D 購(gòu)自 Sigma-Aldrich(St. Louis，M0) 〇
[0172] 將C57BL/6小鼠保持在動(dòng)物園中的特定無(wú)病原體的條件下并隨意飲水和進(jìn)食。所 有動(dòng)物程序均得到我們的Institutional Animal Care and Use Committee批準(zhǔn)。
[0173] 細(xì)胞-MSC使用在實(shí)施例1中描述的程序生成。簡(jiǎn)而言之，收獲6至8周齡的野 生型或aufl-/-小鼠的脛骨和股骨的骨髓。將細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基增補(bǔ) 有10%FBS、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素（完全培養(yǎng)基，全部來(lái)自于 Invitrogen，Carlsbad，CA)。在24小時(shí)之后移除所有的非粘附細(xì)胞，并且保留粘附細(xì)胞。 每2至3天更換培養(yǎng)基。為了獲得MSC克隆，收獲融合細(xì)胞并且通過(guò)限制稀釋法將其接種 在96孔板。然后挑取單個(gè)克隆并擴(kuò)繁。MSC能夠在相應(yīng)的分化條件下分化為脂肪細(xì)胞和成 骨細(xì)胞。使用第15世代前的細(xì)胞。
[0174] T細(xì)胞母細(xì)胞使用分離自C57BL/6小鼠的天然脾細(xì)胞生成，并且培養(yǎng)在RPMI-1640 培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基增補(bǔ)有10%熱滅活？85、21111谷氨酰胺、1001]/1111青霉素、100 1^/1111鏈霉 素和50 y M的0 -ME。使用抗⑶3和抗⑶28激活脾細(xì)胞（1 X 106細(xì)胞/ml) 48小時(shí)并收獲， 將上清液過(guò)濾（0. 1 ym)并冷凍。然后使用的單獨(dú)IL-2(200U/ml)培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)。
[0175] 增殖分析-為了分析T細(xì)胞增殖，將0. 5 y Ci的3H-胸腺嘧啶添加到96孔板 的每個(gè)孔中，6小時(shí)之后通過(guò)冷凍終止培養(yǎng)。然后將板凍融，收獲細(xì)胞并且使用Wallac Microbeta 閃爍計(jì)數(shù)器（Perkin-Elmer，Waltham，MA)評(píng)價(jià)所引入的 3H_Tdr。
[0176] 信使RNA衰減分析-自然進(jìn)行了信使RNA衰減分析。將MSC與細(xì)胞因子組合一起 溫育6小時(shí)。以5 y g/ml的濃度將放線菌素D (Act. D)添加到培養(yǎng)基中以終止轉(zhuǎn)錄。在添 加Act. D后的不同時(shí)間點(diǎn)，收獲細(xì)胞以用于總RNA提取。
[0177] 通過(guò)定量RT-PCR測(cè)量每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的iNOS、CXCL1、CCL2、CXCL10和IL-6mRNA的水 平并針對(duì)肌動(dòng)蛋白mRNA的水平進(jìn)行歸一化。將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)保留的mRNA的百分比針對(duì) Act.D添加后的時(shí)間進(jìn)行作圖。第一階衰減常數(shù)k通過(guò)非線性回歸法進(jìn)行確定。相關(guān)mRNA 半衰期tl/2使用公式tl/2 = ln2/k進(jìn)行計(jì)算。
[0178] RNA分離和表達(dá)分析-總RNA使用RNAprep Pure Cell/Bacteria試劑盒進(jìn)行 分離。第一鏈cDNA合成使用cDNA合成試劑盒進(jìn)行。通過(guò)定量RT-PCR(7900HT;Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)使用 SYBR Green Master Mix 測(cè)量 mRNA 的水平，并且針對(duì) 肌動(dòng)蛋白mRNA進(jìn)行歸一化。正向引物和反向引物對(duì)的序列如下：
[0179] iNOS ：正向 5 ' -CAGCTGGGCTGTACAAACCTT-3 ' 和反向 5' -CATTGGAAGTGAAGCGTTTCG-3' ；
[0180] 0 -肌動(dòng)蛋白：正向 5 ' -CCACGAGCGGITCCGATG-3 '和反向 5r -GCCACAGGATTCCATACCCA-3r ；
[0181] IL-6 :正向 5' -GAGGATACCACTCCCAACAGACC-3' 和反向 5' -AAGTGCATCATCGTTGTTCA TACA-3' ；
[0182] CXCL1 :正向 5' -CTGCACCCAAACCGAAGTC-3' 和反向 5' -AGCTTCAGGGTCAAGGCAAG-3' ；
[0183] CCL2 :正向 5 ' -TCTCTCTTCCTCCACCACCATG-3 ' 和反向 5' -GCGTTAACTGCATCTGGCTGA-3' ；
[0184] CCL5 :正向 5 ' -TTTCTACACCAGCAGCAAGTGC-3 ' 和反向 5' -CCTTCGTGTGACAAACACGAC-3' ；
[0185] CXCL9 :正向 5 ' -AGTGTGGAGTTCGAGGAACCCT-3 ' 和反向 5' -TGCAGGAGCATCGTGCATT-3' ；
[0186] CXCL10 :正向 5 ' -TAGCTCAGGCTCGTCAGTTCT-3 ' 和反向 5' -GATGGTGGTTAAGTTCGTGCT-3'。
[0187] Western印跡分析-使用冰冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，收獲細(xì)胞并且將其于含有蛋 白酶抑制劑（Roche，Natley，NJ)和 PMSF(Sigma)的混合物的 RIPA 緩沖液（Millipore， Temecular，CA)中于冰上裂解30分鐘。通過(guò)在16000g離心15分鐘使裂解物澄清。通過(guò) Bradford assay(Bi〇-Rad，Hercules，CA)確定上清液的蛋白濃度。
[0188]將蛋白樣品稀釋在 5xSDS 上樣緩沖液（250mM Tris-HCl，pH6. 8,10% SDS、0. 5% 溴酚藍(lán)、50%甘油、5% 巰基乙醇）并在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠中分級(jí)。將蛋白電 印跡到硝化纖維素膜（Whatman Inc.，Clifton，NJ)上并在溶解于TBST(150mM NaCl、50mM Tris-HCl、pH 7. 5、0. 05%Tween 20)的5%脫脂奶粉中于室溫溫育1小時(shí)。將印跡膜和初次 抗體一起在4°C溫育過(guò)夜，在TBST中全面洗滌，和HRP-偶聯(lián)二次抗體（Cell Signaling) - 起于室溫溫育1. 5小時(shí)，再用TBST洗滌。印跡膜使用化學(xué)發(fā)光試劑（Mi 11 ipore，Bi 1 lerica， MA)根據(jù)制造商提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行顯色。
[0189] IL-17A受體的免疫熒光檢測(cè)-培養(yǎng)的MSC首先使用PBS洗滌并且使用冰冷甲醇 在-20°C固定10分鐘。在與在PBS中的0.3 % Triton X-100溫育10分鐘之后，使用5 % BSA于室溫將細(xì)胞封閉1小時(shí)并且和初次抗體抗IL-17RA(Santa Cruz)于4°C溫育過(guò)夜。在 用PBS洗滌之后，將細(xì)胞和Alexa Fluor 594偶聯(lián)羊抗兔二次抗體和DAPI(Invitrogen)于 室溫溫育1小時(shí)。然后使用PBS洗滌細(xì)胞后再成像。
[0190] 小鼠中的ConA-誘導(dǎo)的肝損傷-C57BL/6小鼠（8-10周齡）以15mg/kg靜脈注 射在PBS中的ConA(Vector Labs，Burlingame，CA)以誘導(dǎo)肝損傷。源自于野生型小鼠或 aufl-/-小鼠的MSC(5xl05)在IL-17A存在或者不存在的情況下使用或者不使用IFNy、 TNF a處理12小時(shí)（每細(xì)胞因子各10ng/ml)，然后靜脈內(nèi)施用于已經(jīng)使用ConA處理30分 鐘的小鼠中。對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死并且在另外的7. 5小時(shí)后對(duì)血清和肝組織進(jìn)行采樣。血清 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT)活性通過(guò)ALT檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)。福爾馬林固定的肝組織學(xué)切片使 用蘇木精&署紅（H&E)染色。
[0191] 肝單核細(xì)胞分離和流式細(xì)胞法分析-肝單核細(xì)胞（MNC)通過(guò)40 % /70 %梯度 (gradient)純化并且使用抗 CD3-PE、抗 CD4_PerCP/Cy5. 5 和抗 CD8a_APC(eBiosciences) 于4°C在染色緩沖液（PBS、3% FCS)中染色30分鐘。對(duì)于克隆MSC中的IL-17RA的表面 表達(dá)的檢測(cè)，細(xì)胞使用抗IL-17RA-PE(eBiosciences)染色并且通過(guò)流式細(xì)胞法在FACS Calibur 流式細(xì)胞計(jì)（Becton Dickinson，San Jose，CA)上分析。
[0192] 統(tǒng)計(jì)分析-非線性回歸法和統(tǒng)計(jì)分析使用PRISM v5軟件（GraphPad Software， Inc.)進(jìn)行。使用非配對(duì)的t檢驗(yàn)進(jìn)行樣品間比較。P < 0. 05的差異被認(rèn)為是顯著的（*， P < 0? 05 ;**，P < 0? 01 ;***，P < 0? 001)。
[0193] 結(jié)果-IL-17A增強(qiáng)了 MSC的免疫抑制作用
[0194] 本實(shí)施例提供了 MSC的免疫抑制功能不是先天的而是受到促炎細(xì)胞因子以濃度 依賴方式誘導(dǎo)。IFNy與三種其他促炎細(xì)胞因子-TNFa、IL-la或IL-1P中的一個(gè)的組 合對(duì)于使MSC能夠具有免疫抑制作用是需要的。IL-17A是一種多效性促炎細(xì)胞因子，其在 各種炎性和自體免疫性疾病的致病機(jī)理中的關(guān)鍵作用是已知的。令人感興趣的是，還已知 IL-17A與某些細(xì)胞因子協(xié)同促進(jìn)炎癥需要的基因表達(dá)程序。因此，本發(fā)明人檢查了 IL-17A 是否能夠與次優(yōu)濃度的IFNy和TNFa協(xié)同誘導(dǎo)MSC的免疫抑制性能。
[0195] 將MSC與低濃度（各2ng/ml)的重組細(xì)胞因子IFNy、TNF a和IL-17A的各種組 合培養(yǎng)12小時(shí)；將⑶4+T細(xì)胞母細(xì)胞以1 : 20比例（MSC : T細(xì)胞）和E-2 -起添加到 培養(yǎng)物中，并且T細(xì)胞增殖通過(guò)3H-胸腺嘧啶引入法進(jìn)行評(píng)估（注意T細(xì)胞母細(xì)胞在IL-2 存在的情況下增殖，但是它們?cè)跊](méi)有進(jìn)一步的TCR激活的情況下沒(méi)有生成細(xì)胞因子）。然后 得出結(jié)論，即三種細(xì)胞因子不能單獨(dú)誘導(dǎo)MSC中的免疫抑制。
[0196] MSC首先使用重組細(xì)胞因子IFNy、TNFa、IL-17A (各2ng/ml)的所示組合處理12 小時(shí)，然后與CD4+T細(xì)胞母細(xì)胞以1 : 20的比例（MSC : T細(xì)胞）共培養(yǎng)，并在另外的12小 時(shí)之后通過(guò)3H_胸腺嘧啶引入法評(píng)價(jià)增殖。因此，T細(xì)胞增殖在IFNy和TNFa存在的情況 下受到抑制，并且這種抑制能夠受到IL-17A的顯著增強(qiáng)（圖9A)，表明IL-17A具有新的免 疫調(diào)節(jié)功能，是一種強(qiáng)效的促炎細(xì)胞因子。
[0197] MSC或Raw 264. 7 (巨噬細(xì)胞）中的IL-17受體家族成員的mRNA表達(dá)然后通過(guò) RT-PCR NC :No RT.進(jìn)行檢查。同樣地，IL-17A通過(guò)IL-17RA和IL-17RC進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，兩 種受體在MSC中的表達(dá)通過(guò)RT-PCR得到證實(shí)（圖9B)，其中小鼠巨噬細(xì)胞系Raw 264. 7被 用作陽(yáng)性對(duì)照；IL-17RA的細(xì)胞表面表達(dá)也通過(guò)間接免疫熒光顯微法和流式細(xì)胞法得到證 實(shí)（圖9C，分別在上圖和下圖）。
[0198] 由于炎性細(xì)胞因子的濃度在不同的炎性反應(yīng)階段發(fā)生變化，因此進(jìn)一步評(píng)價(jià) IFN y和TNF a對(duì)IL-17A增強(qiáng)的免疫抑制的濃度依賴性。將MSC和具有所示濃度的IFN Y 和TNFa -起在沒(méi)有或者有l(wèi)〇ng/ml IL-17A的情況下培養(yǎng)。MSC然后與⑶4+T細(xì)胞母細(xì) 胞或Al. 1T細(xì)胞雜交瘤共培養(yǎng)以評(píng)價(jià)對(duì)T細(xì)胞增殖的作用。IL-17A在低至各l-2ng/ml的 IFNy和TNFa濃度下能夠增強(qiáng)MSC對(duì)T細(xì)胞的免疫抑制作用（圖9D、9E)。
[0199] 即使在較高的IFNy和TNFa濃度（即l〇-20ng/ml)，IL-17A仍然提高了免疫 抑制，盡管該作用沒(méi)有那么顯著。但是，MSC使用IFNy和TNFa (2ng/ml)在梯度濃度的 IL-17A下處理12小時(shí)，并且然后與T細(xì)胞雜交瘤Al. 1細(xì)胞以1 : 10的比例共培養(yǎng)12小 時(shí)。結(jié)果，低濃度的IFN Y和TNF a (各2ng/ml)，低至0? 5ng/ml的IL-17A就足以引發(fā)T細(xì) 胞增殖的急劇下降（P < 〇. 05 ;圖9F)。
[0200] 這個(gè)觀測(cè)結(jié)果提供了 MSC能夠抑制激活原生脾細(xì)胞的增殖，這依賴于由T細(xì)胞分 泌的炎性細(xì)胞因子。T細(xì)胞的激活導(dǎo)致很多細(xì)胞因子包括IL-17A的生成。為了證實(shí)IL-17A 有助于MSC的免疫抑制作用，使用抗IL-17A抗體于MSC激活的脾細(xì)胞共培養(yǎng)物體系中將其 中和。雖然激活的脾細(xì)胞的增殖受到MSC的顯著抑制，但是這種抑制在添加抗IL-17A的抗 體之后受到部分逆轉(zhuǎn)，即，在抗體存在的情況下增殖增加（圖9G)。抗體的優(yōu)化作用在MSC : 脾細(xì)胞比例為1 : 40時(shí)出現(xiàn)。采用1 : 20的MSC :脾細(xì)胞比例，逆轉(zhuǎn)沒(méi)有那么顯著，但是 仍然具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（p < 〇. 01)?？偠灾?，這些結(jié)果表明IL-17A能夠增強(qiáng)MSC的免疫 抑制作用，特別是在它們?cè)谳^低濃度的IFNy和TNFa中培養(yǎng)的時(shí)候。
[0201] IL-17A與炎性細(xì)胞因子協(xié)同誘導(dǎo)MSC中的免疫調(diào)芐基因的表達(dá)
[0202] -氧化氮（NO)和協(xié)同作用的趨化因子是介導(dǎo)MSC的免疫抑制作用的關(guān)鍵分子。 MSC中的趨化因子和iNOS基因受到IFNy和TNFa的誘導(dǎo)。但是，IL-17A增強(qiáng)了與IFNy 和TNFa共培養(yǎng)的MSC引起的免疫抑制（圖9D、9E)。設(shè)計(jì)本研究以顯示IL-17A與IFNy和 TNFa協(xié)同誘導(dǎo)iNOS和趨化因子在MSC中的表達(dá)。為了檢驗(yàn)這種推測(cè)，將MSC群與IFNy、 TNF a和/或IL-17A的各種組合一起培養(yǎng)，并評(píng)價(jià)對(duì)所選的免疫調(diào)芐基因的表達(dá)的作用。
[0203] 與和單獨(dú)的細(xì)胞因子或細(xì)胞因子的兩種組合一起培養(yǎng)的MSC相比，添加IFNy、 TNFa和IL-17A顯著地增加了 iN0S、IL-6和CXCL1在mRNA水平上的表達(dá)（圖10A) ;Western 印跡分析證實(shí)iNOS蛋白水平也增加（圖10B)。但是，其他趨化因子例如在MSC的免疫抑制 作用中發(fā)揮樞紐作用的CCL5、CCL2、CXCL9、CXCL10的表達(dá)全都沒(méi)有受到添加IL-17A的影 響（圖10C)。
[0204] 為了證實(shí)對(duì)基因表達(dá)的影響是因?yàn)镮L-17A，將MSC與來(lái)自抗⑶3和抗⑶28激活 的脾細(xì)胞的上清液在抗IL-17A的中和抗體存在或者不存在的情況下培養(yǎng)。向上清液添加 抗IL-17A阻斷了 iNOS、IL-6和CXCL1基因表達(dá)的誘導(dǎo)但是沒(méi)有影響CCL2、CCL5、CXCL9或 CXCL10 (圖10D、10E)。使用Actl敲低MSC阻斷IL-17A的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)一步證實(shí)了這個(gè)結(jié)論。
[0205] 向IL-17RA募集適配體蛋白Actl與IL-17A依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)聯(lián)。由于IkB a、 ERK、p65、JNK的磷酸化在這些Actl敲低MSC中受到損害（圖11A)，因此IL-17A不能上調(diào) Acll敲低MSC中的IFNy+TNFa誘導(dǎo)的iNOS表達(dá)（圖11B，11C)。同時(shí)，MSC中由IL-17A 引起的免疫抑制的增強(qiáng)在缺少Actl的情況下也沒(méi)有見(jiàn)到（圖11D)。因此，對(duì)基因表達(dá)的影 響是因?yàn)镮L-17A的緣故?？偠灾@些數(shù)據(jù)表明，IL-17A能夠與IFNy和TNFa協(xié)同誘 導(dǎo)有助于MSC的免疫抑制功能的基因的表達(dá)。
[0206] IL-17A逆轉(zhuǎn)由RNA結(jié)合蛋白AUF1施加的基因表達(dá)抑制
[0207] 編碼iNOS和很多細(xì)胞因子/趨化因子的信使RNA迅速降解，這限制了 mRNA和蛋 白兩者的豐度。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活特別是在免疫反應(yīng)過(guò)程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活穩(wěn)定 了很多這些mRNA從而增加了它們的表達(dá)。實(shí)際上，IL-17A誘導(dǎo)很多炎性調(diào)節(jié)子基因的表達(dá) 的主要機(jī)制是通過(guò)穩(wěn)定它們的mRNA來(lái)實(shí)現(xiàn)的。很多蛋白結(jié)合至特定的RNA序列（該序列 通常位于3'-UTR中）并且靶向mRNA以快速降解。富含AU元件（ARE)包含一個(gè)這樣mRNA 降解序列家族。有很多這樣的蛋白，這些蛋白結(jié)合至ARE以引發(fā)含有它們的mRNA的受控 表達(dá)。這些蛋白包括AUF1、HuR、KSRP、TIA-1/TIAR和TTP。這些蛋白的一些標(biāo)靶包括編碼 iNOS、IL-6 和 CXCL1 的 ARE-mRNA。ARE 結(jié)合蛋白 AUF1 由四個(gè)異構(gòu)體-p37、p40、p42 和 p45 組成-這些異構(gòu)體結(jié)合并且調(diào)節(jié)iNOS和IL-6mRNA的降解。因此推測(cè)AUF1可能起到限制 iNOS和細(xì)胞因子/趨化因子mRNA表達(dá)的作用，并且E-17A可能阻斷AUF1的這種活性，由 此增加基因的表達(dá)。
[0208] 因此，比較了源自于aufl /小鼠和野生型小鼠的骨髓的MSC之間的細(xì)胞因子誘 導(dǎo)的基因表達(dá)。如前文所述，在用或者不用IL-17A的情況下將細(xì)胞與細(xì)胞因子的組合一 起培養(yǎng)。雖然iNOS、IL-6和CXCLlmRNA的水平一般來(lái)說(shuō)在野生型MSC中非常低，但是添加 IL-17A (和IFNy和TNFa -起）誘導(dǎo)了這些mRNA的顯著增加（圖12A;p< 0.001)。相反， 這三種mRNA的水平在與IFNy+TNFa -起培養(yǎng)的aufl XMSC中高得多，并且添加IL-17A 對(duì)mRNA水平幾乎沒(méi)有作用（即IL-17A增加了它們的豐度不到兩倍）。同樣的，IFNy和 TNFa足以最大地誘導(dǎo) aufl /MSC中的iNOS蛋白而不需要IL-17A，這與野生型的MSC不同 (圖12B，比較泳道7和8與泳道5)。
[0209] 考慮到AUF1和IL-17A對(duì)基因表達(dá)的作用，單獨(dú)敲除AUF1可能足以提供mRNA穩(wěn)定 程度以及增高的基因表達(dá)，這一般需要IL-17A。野生型和auf^MSC在用或者不用IL-17A 的情況下與IFN y +TNF a培養(yǎng)。6小時(shí)后，添加Act. D以終止轉(zhuǎn)錄。
[0210] 在不同的時(shí)間點(diǎn)，從細(xì)胞分離RNA并且確定個(gè)體mRNA的水平以評(píng)價(jià)mRNA衰減動(dòng) 力學(xué)。在野生型MSC中，iNOS、IL-6和CXCLlmRNA相對(duì)不穩(wěn)定，半衰期分別為4. 3± 1. 4小 時(shí)，0. 7±0. 1小時(shí)，和0. 59±0. 08小時(shí)；IL-17A導(dǎo)致所有三種mRNA穩(wěn)定兩倍（圖13A ;每 個(gè)都是P < 〇. 05)。CCL2和CXCLIOmRNA對(duì)IL-17A沒(méi)有響應(yīng)（見(jiàn)圖13C)，如所預(yù)期的那樣， 它們不受IL-17A的穩(wěn)定化（圖13A ;對(duì)于兩種mRNA均為tl/2 =~2小時(shí)，在用或者不用 IL-17A情況下）。
[0211] 與野生型MSC不同，敲除AUF1強(qiáng)烈穩(wěn)定iNOS、IL-6和CXCLlmRNA(圖13B ;對(duì)于 iNOS 和 IL-6, tl/2 > 10 小時(shí)；對(duì)于 CXCL1，tl/2 = 4. 3±0. 6 小時(shí)）。IL-17A 對(duì) iNOS 和 IL-6mRNA的半衰期沒(méi)有影響（圖13B)，但是其穩(wěn)定了 CXCLlmRNA至少兩倍（圖13B ;tl/2 > 10小時(shí)與4. 3±0. 6小時(shí)（沒(méi)有IL-17A)，參見(jiàn)討論部分）。這些mRNA衰減數(shù)據(jù)表明，（i) AUF1正常情況下促進(jìn)了 MSC中iNOS、IL-6和CXCLlmRNA的降解，而IL-17A導(dǎo)致它們的穩(wěn) 定；（ii)敲除AUF1導(dǎo)致的這些mRNA的穩(wěn)定與IL-17A對(duì)野生型MSC中的mRNA的穩(wěn)定作用 相當(dāng)；和（iii)AUFl敲除顯示為避免需要IL-17A來(lái)誘導(dǎo)iNOS/趨化因子基因表達(dá)。因此， AUF1可以用作這樣的一種對(duì)照點(diǎn)，通過(guò)該對(duì)照點(diǎn)，IL-17A必然起到引導(dǎo)其對(duì)MSC基因表達(dá) 的影響，并且可能引起對(duì)最終的免疫抑制的影響，這一點(diǎn)將在下文進(jìn)行檢查。
[0212] AUF1對(duì)由MSC引起的免疫抑制的體外影響
[0213] 考慮到AUF1敲除誘導(dǎo)趨化因子基因表達(dá)而無(wú)需IL-17A (見(jiàn)圖12和13)，推測(cè)單獨(dú) 使用IFNy+TNFa培養(yǎng)auf^MSC將足以在表型上復(fù)制（phenocopy)使用所有三種細(xì)胞因 子培養(yǎng)的野生型MSC的免疫抑制活性。為了證明這種推測(cè)，在用或者不用IL-17A的情況下 使用IFNy+TNFa培養(yǎng)野生型和aufl /-MSC，并且然后與Al. 1T細(xì)胞雜交瘤一起培養(yǎng)以分 析T細(xì)胞增殖。與沒(méi)有IL-17A的情況下培養(yǎng)的細(xì)胞相比，IL-17A增加了野生型MSC的免 疫抑制活性；但是，IFN y +TNF a足以誘導(dǎo)aufl / MSC的最大免疫抑制活性，而IL-17A不能 進(jìn)一步增強(qiáng)免疫抑制作用（圖14. A、14B)。經(jīng)綜合考慮，這些結(jié)果與AUF1限制iNOS和細(xì)胞 因子/趨化因子基因表達(dá)的觀測(cè)結(jié)果是吻合的；IL-17A逆轉(zhuǎn)了這種作用從而增強(qiáng)了由MSC 引起的免疫抑制。
[0214] IL-17A以AUF1依賴型方式增強(qiáng)了 MSC在患有ConA誘導(dǎo)的肝損傷的小鼠中的治療 作用
[0215] 接著本發(fā)明人檢查了 IL-17A對(duì)野生型和auf^MSC引起的體內(nèi)免疫抑制的影 響。小鼠中ConA誘導(dǎo)的肝損傷是主要由T細(xì)胞介導(dǎo)的自體免疫性肝炎的被充分描述過(guò)的 體內(nèi)模型。由于以前的結(jié)果表明IL-17A能夠急劇增強(qiáng)MSC在體外系統(tǒng)中的免疫抑制作 用，因此預(yù)期IL-17A可能能夠使MSC在治療小鼠中ConA誘導(dǎo)的肝損傷中具有更好的治療 作用。因此，在存在或不存在IL-17A的情況下，首先處理有和沒(méi)有IFN y+TNF a的野生型 和aufl-/-MSC 12小時(shí)，然后將它們靜脈內(nèi)注射到30分鐘前接受了 ConA注射的小鼠。與 沒(méi)有處理或經(jīng)IFNy+TNFa預(yù)處理的野生型MSC相比，IFNy+TNFa和IL-17A預(yù)處理的 MSC基本能夠減輕肝損壞，血清ALT活性和肝壞死和炎癥急劇下降（圖15A、15D)。...