微波中加熱3小時(shí)。冷卻之后，通過制備HPLC純化該 反應(yīng)混合物（乙腈：水（+0. 05%甲酸)梯度)。由此得到168mg標(biāo)題化合物（理論值的62%， 純度97%)。 5H-Nr^R \?Ηλ DM$0-d's 5^; U仇、·Η、.，：iD W'Wm'出)' 2 >、了、{m, 乂:以kt n奶{dd、mi h ；? i、hr、 ，ill、
[0119] 分離為對映異構(gòu)體： 在手性相（DaicelChiralpakAZ-H，5μΜ，250x20mm)上通過制備HPLC將 301mg外消旋體(來自2個(gè)不同批次的合并量的實(shí)施例1)分離為對映異構(gòu)體(流動(dòng)相：（異己烷/ 乙醇 30/70 (v/v)，流速 15ml/min，溫度 40°C，波長：220nm)。
[0120] 實(shí)施例1-1(對映異構(gòu)體1) (5S)-2-{5-氟-l-[(3-氟吡啶-2-基）甲基]-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5_甲 基-5_ (二氣甲基）_4_ [ (3, 3, 3-二氣丙基）氨基]-5, 7-二氫-6H-R比略并[2, 3_d]啼 啶-6-酮 產(chǎn)率：138mg
Rt = 4.056 min;ee>99%[分析HPLC，流動(dòng)相：異己燒/ 乙醇30/70 (v/v)，流速1 ml/min，溫度40°C，波長：220 nm，在手性相上（Daicel Chiralpak AZ-H, 5 μΜ 250 X 4.6 mm) ]〇
[0121 ] 單晶X射線結(jié)構(gòu)分析證明了此對映異構(gòu)體的S構(gòu)型。
[0122] 實(shí)施例1-2 (對映異構(gòu)體2) (5R)-2-{5-氟-l-[(3-氟吡啶-2-基）甲基]-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5_甲 基-5_ (二氣甲基）_4_ [ (3, 3, 3-二氣丙基）氨基]-5, 7-二氫-6H-R比略并[2, 3_d]啼 啶-6-酮
產(chǎn)率：145mg Rt = 5.576min，ee> 99% [分析HPLC，流動(dòng)相：異己烷 / 乙醇 30/70 (v/v)，流速 1ml/min，溫度 40°C，波長：220nm，在手性相上（DaicelChiralpakAZ-H, 5μΜ250X 4. 6mm) ] 〇
[0123] B.藥理學(xué)功效的評價(jià) 下文中使用以下縮寫： BSA 牛血清白蛋白 EDTA 乙二胺四乙酸 MCi 微居里 Tris 三（羥甲基）氨基甲烷。
[0124] 本發(fā)明化合物的藥理學(xué)作用可在以下測試中顯示： B-1.體外血管松弛作用 將兔從頸部打昏，然后放血。將主動(dòng)脈從粘附組織中移出，并分割成1.5_寬的環(huán)。將 所述環(huán)在初始張力下分別放置于5-ml器官浴槽（organbaths)中，所述器官浴槽具有在 37°C下通氣有卡波金（carbogen)的Krebs-Henseleit溶液，所述溶液具有下述組成(各自 單位為mM):氯化鈉：119 ;氯化鉀：4. 8 ;二水合氯化鈣：1 ;七水合硫酸鎂：1. 4 ;磷酸二氫鉀： 1. 2 ;碳酸氫鈉：25 ;葡萄糖：10。用StathamUC2細(xì)胞測定并增強(qiáng)收縮力，使用A/D轉(zhuǎn)換器 (DAS_1802HC，KeithleyInstrumentsMunich)數(shù)字化，然后平行記錄在線型記錄儀上。為 了產(chǎn)生收縮，以不斷增加的濃度將苯基腎上腺素（phenyl印hrine)累積加入到所述浴槽中。 在若干對照循環(huán)后，在每個(gè)另外的運(yùn)行中每次以增加的劑量加入待研究的物質(zhì)，并且將獲 得的收縮高度與在最后的在先運(yùn)行中獲得的收縮高度進(jìn)行比較。這用于計(jì)算使對照值的量 減小50%所需的濃度（IC5。值)。標(biāo)準(zhǔn)給藥體積為5μ1 ;在浴槽溶液中的DMS0含量對應(yīng)于 0. 1%〇
[0125] 本發(fā)明化合物的代表性IC5。值在下表(表1)中示出： 表1:
[0126] B-2.對重組鳥苷酸環(huán)化酶報(bào)告細(xì)朐系的作用一 如F.Wunder等人在如aZBiochem. 339, 104-112 (2005)中描述的那樣，在重組鳥 苷酸環(huán)化酶報(bào)告細(xì)胞系上測定本發(fā)明化合物的細(xì)胞活性。
[0127] 本發(fā)明化合物的代表值(MEC=最低有效濃度）在下表中示出(表2): 表2:
[0128] B-3.對有意識(shí)的、自發(fā)件高血壓大鼠的血壓的無線電遙測測量 使用來自DATASCIENCESINTERNATIONALDSI，USA的市售遙測系統(tǒng)對下文所述的有意 識(shí)的大鼠進(jìn)行血壓測量。
[0129] 該系統(tǒng)由3個(gè)主要組件組成： -可植入發(fā)射器（Physiotel?遙測發(fā)射器） _接收器（Physiotel?接收器)，其經(jīng)由多路轉(zhuǎn)接器（Multiplexer，DSIDataExchange Matrix)連接于 -數(shù)據(jù)采集計(jì)算機(jī)。
[0130] 所述遙測系統(tǒng)能夠連續(xù)記錄有意識(shí)的動(dòng)物在其通常棲息地中的血壓、心率和身體 動(dòng)作。
[0131] 動(dòng)物材料 研究在體重>200g的成年雌性自發(fā)性高血壓大鼠（SHROkamoto)中進(jìn)行。來自O(shè)kamoto KyotoSchoolofMedicine(1963)的SHR/NCrl是具有極其升高的血壓的雄性Wistar Kyoto大鼠與具有輕微升高的血壓的雌性大鼠的雜交種，在F13時(shí)其被送至美國國立衛(wèi)生 研究院（U.S.NationalInstitutesofHealth)。
[0132] 在將發(fā)射器植入后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被單獨(dú)圈養(yǎng)在3型Makrolon籠中。其可自由攝取標(biāo) 準(zhǔn)飼料和水。
[0133] 通過在早上6:00以及在晚上7:00的室內(nèi)照明改變在測試實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的晝/夜節(jié) 律。
[0134] 發(fā)射器棺入 在第一次實(shí)驗(yàn)應(yīng)用之前至少14天，將所用的遙測發(fā)射器TA11PA-C40在無菌條件下手 術(shù)植入到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中。以此方式裝備了儀器的動(dòng)物可在傷口愈合以及將植入物植入后被重 復(fù)使用。
[0135] 在流動(dòng)容器中用含5%異氟烷的02+N20氣體30:50開始啟動(dòng)麻醉。
[0136] 在開始啟動(dòng)麻醉后，將麻醉面罩覆在動(dòng)物上，所述動(dòng)物位于保溫板上，并給藥1. 8% 異氟烷以維持麻醉。然后在動(dòng)物腹部的大面積區(qū)域上剃毛并消毒。在沿著腹白線打開腹腔 后，將該系統(tǒng)的裝滿液體的測量導(dǎo)管在分叉點(diǎn)上方沿顱骨方向插入到降主動(dòng)脈中并用組織 膠（VetBonD?，TM，3M)固定。將所述發(fā)射器的外殼在腹腔內(nèi)固定至腹壁肌肉組織上，且傷 口被層層封閉。
[0137]在術(shù)后，給予用于預(yù)防感染的抗生素（Oxytetracyclin? 10%, 60mg/kgs.c.， 0.06ml/100g體重，Beta-PharmaGmbH&Co,Germany)和止痛劑（Rimadyl?, 4mg/kg s.c. ,Pfizer,Germany) 〇
[0138] 物質(zhì)和溶液 除非另有說明，否則將待研究的物質(zhì)通過強(qiáng)飼法分別口服給藥至一組動(dòng)物（n=6)。適合 于2ml/kg體重的給藥體積，將測試物質(zhì)溶解在合適的溶劑混合物中或懸浮在0. 5%濃度的 甲基纖維素中。
[0139] 溶劑治療的動(dòng)物組被用作對照組。
[0140] 測試討稈 將本發(fā)明的遙測測量單元配置給24只動(dòng)物。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均以實(shí)驗(yàn)編號進(jìn)行記錄（以年月 日記)。
[0141] 給在所述系統(tǒng)中生存的每只裝備了儀器的大鼠分配單獨(dú)的接收天線（1010 Receiver，DSI)〇
[0142] 植入的發(fā)射器可通過所結(jié)合的磁開關(guān)從外部進(jìn)行激活，并在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)將其轉(zhuǎn)換 至發(fā)射。所發(fā)射的信號可通過數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)（DataquestTMA.R.T.用于WIND0WS，DSI) 在線探測并適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行處理。數(shù)據(jù)被分別儲(chǔ)存在為此目的而創(chuàng)建并帶有實(shí)驗(yàn)編號的文件夾 中。
[0143] 在標(biāo)準(zhǔn)步驟中，分別測量以下指標(biāo)10秒： -收縮血壓（SBP) -舒張血壓（DBP) -平均動(dòng)脈壓（MAP) -心率（HR) -活性(ACT)。
[0144] 在計(jì)算機(jī)控制下按5分鐘的間隔重復(fù)獲得測量值。在圖表中用當(dāng)前測量的氣壓 (環(huán)境壓力參考監(jiān)視器；APR-1)校正作為絕對數(shù)值獲得的源數(shù)據(jù)并將其儲(chǔ)存為單獨(dú)的數(shù)據(jù)。 制造公司（DSI)的大量文件中給出了其它的技術(shù)細(xì)節(jié)。
[0145] 除非另有說明，否則在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天上午9:00時(shí)給藥測試物質(zhì)。在給藥后，在24小時(shí) 內(nèi)測量上述參數(shù)。
[0146] 數(shù)據(jù)處理 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用分析軟件（DATAQUESTTMA.R.T.TMANALYSIS)分類所采集的各 個(gè)數(shù)據(jù)。將給藥前2小時(shí)的值作為空白值，以使所選擇的數(shù)據(jù)集包括從實(shí)驗(yàn)當(dāng)天上午7:00 時(shí)至后一天上午9:00時(shí)的時(shí)期。
[0147] 通過測定平均值在預(yù)定時(shí)間內(nèi)對數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑(平均30分鐘)，并將數(shù)據(jù)作為文本 文檔轉(zhuǎn)移至儲(chǔ)存介質(zhì)中。將以這種方式預(yù)分類并壓縮的測量值轉(zhuǎn)移到Excel模板中并作為 表格呈現(xiàn)。將每個(gè)實(shí)驗(yàn)日所獲得的數(shù)據(jù)儲(chǔ)存在帶有實(shí)驗(yàn)編號的專門文件夾中。將結(jié)果和實(shí) 驗(yàn)記錄以通過編號分類進(jìn)行存檔。
[0148] 下表(表3)中示出了本發(fā)明化合物的代表值： 表3:
[0149] 文獻(xiàn) KlausWitte,KaiHu,JohannaSwiatek,ClaudiaMlissig,GeorgErtlandBjorn Lemmer:Experimentalheartfailureinrats:effectsoncardiovascularcircadian rhythmsandonmyocardialβ-adrenergicsignaling.CardiovascRes47 (2): 203-405， 2000;KozoOkamoto:Spontaneoushypertensioninrats.IntRevExp Pathol7: 227- 270, 1969;MaartenvandenBuuse:CircadianRhythmsofBlood Pressure,HeartRate,andLocomotorActivityinSpontaneouslyHypertensiveRats asMeasuredWithRadio-Telemetry.Physiology&Behavior55(4): 783-787, 1994〇
[0150] B-4.在靜脈內(nèi)和口服給葯后測定葯物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù) 在雄性CD-1小鼠、雄性Wistar大鼠和雌性小獵犬中測定本發(fā)明式（I)化合物的藥 物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在小鼠和大鼠中的靜脈內(nèi)給藥通過特定物種血漿/DMS制劑的方式 來實(shí)施；在犬類中的靜脈內(nèi)給藥通過水/PEG400/乙醇制劑的方式來實(shí)施。在所有的物種 中，通過強(qiáng)飼法，基于水/PEG400/乙醇制劑來實(shí)施所溶解物質(zhì)的口服給藥。在給藥物質(zhì)之 前，將硅酮導(dǎo)管插入大鼠的右側(cè)頸外靜脈中，以更容易地從大鼠中移出血液。在用異氟烷 (Isofluran)麻醉并給藥止痛劑（阿托品/卡布洛芬（Rimadyl) (3/1) 0·lml皮下給藥）之 前至少一天進(jìn)行手術(shù)。在時(shí)間窗內(nèi)取血(通常多于10個(gè)時(shí)間點(diǎn))，所述時(shí)間窗包括給藥物質(zhì) 之后至少24小時(shí)至最大72小時(shí)的時(shí)間終點(diǎn)。將血液移入肝素化的試管中。然后通過離心 獲得血漿；如果需要，將其儲(chǔ)存在-20°C下直至進(jìn)一步處理。
[0151] 將內(nèi)標(biāo)(其也可以是化學(xué)不相關(guān)的物質(zhì)）加入到本發(fā)明式（I)化合物的樣品、校準(zhǔn) 樣品和合格者中，接著通過使用過量乙腈使蛋白質(zhì)沉淀。加入與LC條件匹