配的緩沖溶液， 隨后形成渦流，接著在1000g下進(jìn)行離心。通過LC-MS/MS法使用C18反相柱和可變流動(dòng) 相混合物分析上清液。由具體選擇的離子監(jiān)測實(shí)驗(yàn)的提取離子色譜通過峰高或峰面積來量 化所述物質(zhì)。
[0152] 使用經(jīng)驗(yàn)證的藥物代謝動(dòng)力學(xué)計(jì)算程序，由所測定的血漿濃度/時(shí)間曲線來計(jì)算 藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)，例如AUC(在曲線下的面積)、C_、t1/2 (終末半衰期)、F(生物可利用 率)、MRT(平均滯留時(shí)間）和CL(清除率)。
[0153] 由于所述物質(zhì)的量化在血漿中進(jìn)行，為了能夠相應(yīng)地調(diào)整藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)， 必須測定所述物質(zhì)的血液/血漿分布。為此，在滾輥混合器中將限定量的物質(zhì)在相應(yīng)物種 的肝素化全血中孵育20分鐘。以1000g離心后，測量血漿中的濃度(通過LC-MS/MS法；參 見上文)，并通過計(jì)算(?? /Ctfjjj值的比例來確定。
[0154] 表4顯示了在大鼠中靜脈給藥0. 3mg/kg和口服給藥1mg/kg后本發(fā)明代表性化 合物的數(shù)據(jù)。
[0155]表 4:
[0156] B-5.代謝研究 為測定本發(fā)明化合物的代謝情況，將其與以下物質(zhì)一起孵育：重組人細(xì)胞色素P450(CYP)酶、肝微粒體或來自不同動(dòng)物物種(例如大鼠、狗）以及人源的原代新鮮肝細(xì)胞， 從而獲得并比較以下有關(guān)信息：盡可能完整肝階段I和階段II代謝，以及所述代謝中涉及 的酶。
[0157] 以約0. 1-10μΜ的濃度孵育本發(fā)明的化合物。為此，制備濃度為0.01-lmM的本 發(fā)明化合物的乙腈母液，然后以1:100的稀釋度移液到孵育混合物中。在37°c下，在50mM 磷酸鉀緩沖液（PH7.4)中孵育肝微粒體和重組酶，所述緩沖液具有或不具有由ImMNADP+、 10mM葡萄糖-6-磷酸和1個(gè)單位的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶組成的NADPH生成體系。還在 37°C下，將原代肝細(xì)胞懸浮孵育在WilliamsE培養(yǎng)基中。在孵育0-4小時(shí)后，用乙腈(終濃 度為約30%)終止孵育混合物，并且以約15000Xg將蛋白質(zhì)離心出來。直接分析由此終止 的樣品，或?qū)⑵鋬?chǔ)存在_20°C下直至進(jìn)行分析。
[0158] 所述分析通過帶有紫外和質(zhì)譜檢測的高效液相色譜法（HPLC-UV-MS/MS)進(jìn)行。為 此，用適合的C18反相柱和可變流動(dòng)相混合物（乙腈和10mM甲酸銨水溶液或0. 05%甲酸)對(duì) 孵育樣品的上清液進(jìn)行色譜分析。UV色譜圖和質(zhì)譜數(shù)據(jù)用于代謝物的鑒別、結(jié)構(gòu)解析和定 量評(píng)價(jià)，以及用于孵育混合物中本發(fā)明化合物的定量代謝減少。
[0159] B-6.牛磷酸二醅IS6(PDE6)的抑制 PDE6純化自牛視網(wǎng)膜（R0S)的外部光感受器片段，其通過溫和胰蛋白酶化活化并且 進(jìn)一步用MonoQ管柱通過離子交換色譜法純化。將具有TOE6活性的餾份合并（PDE6制 劑）并在 _80。下存儲(chǔ)（I.SaenzdeTejada等，InternationalJournalofImpotence Research2001，13,282-290)。使用來自PerkinElmer的可商購的 3H-cGMPScintillation ProximityAssay(SPA)來測定測試物質(zhì)對(duì)牛FOE6的體外作用。該反應(yīng)（20分鐘，37°C) 包括在DMS0中的測試物質(zhì)的一系列稀釋系列和TOE6制劑（典型稀釋1:100, 000)，[8-?] 鳥苷 3'，5' -環(huán)磷酸酯（0· 25μCi/mL;PerkinElmer)和在分析緩沖液（50mMTris/HClpH 7· 5 ;140mMNaCl;8. 3mMMgC12 ;1. 7mMEDTA;0· 02%BSA)中的未標(biāo)記cGMP(10μΜ)。通過 將物質(zhì)濃度對(duì)百分比FOE6抑制做圖來確定IC5(^ (Wunder等，MolecularPharmacology 2005,68,1775-1781)。
[0160] 本發(fā)明化合物的代表性IC5。值在下表(表5)中示出： 表5:
[0161] B7.在對(duì)大鼠的長期實(shí)驗(yàn)中測宙器官保護(hù)作用 大鼠中與治療相關(guān)的"低一氧化氮（N0)/高腎素"高血壓模型顯示了sGC刺激劑的 器官保護(hù)作用。該研究根據(jù)在最近公開的文章（SharkovskaY,KalkP,LawrenzB, GodesM,HoffmannLS,ffellkischK,GeschkaS,RelleK,HocherB,StaschJP. N〇-independentstimulationofsolubleguanylatecyclasereducestargetorgan damageinlow-andhigh-reninmodelsofhypertension.J.Hypertension. 2010; 28: 1666-1675)實(shí)施。這包括治療腎素轉(zhuǎn)基因大鼠（TGR(mRen2)27)，其中，在幾個(gè)星期內(nèi) 通過飲用水對(duì)所述大鼠同時(shí)給藥N0合成酶抑制劑L-NAME和sGC刺激劑或載體。在治療期 間，測定血液動(dòng)力學(xué)和腎功能的參數(shù)。在長期研究結(jié)束時(shí)，由組織病理學(xué)研究、生物標(biāo)志物、 表達(dá)分析和心血管等離子體參數(shù)顯示出器官（腎、肺、心臟、主動(dòng)脈）保護(hù)。
[0162] C.藥物組合物的工作實(shí)施例 本發(fā)明的化合物可以被轉(zhuǎn)化成如下的藥物制劑： 片劑： 組成： 100mg本發(fā)明的化合物、50mg乳糖（一水合物)、50mg玉米淀粉(天然)、10mg聚乙稀P比 略燒酮（PVP25) (BASF,Ludwigshafen,Germany)和 2mg硬脂酸儀。
[0163] 片劑重212mg、直徑8mm、弧形半徑12mm。
[0164]制備: 將本發(fā)明的化合物、乳糖和淀粉的混合物用5% (m/m)的PVP水溶液進(jìn)行制粒。將所述 顆粒干燥，然后與硬脂酸鎂混合5分鐘。該混合物用常規(guī)壓片機(jī)壓縮(對(duì)于片劑尺寸，參見 上文)。用于壓縮的指導(dǎo)值為15kN的壓力。
[0165] 用于口服給藥的懸液劑： 組成： lOOOrng本發(fā)明的化合物、lOOOrng乙醇（96%)、400mgRhodigel? (購自FMC，Pennsylvania，USA的黃原膠）以及99g水。
[0166] 100mg本發(fā)明化合物的單一劑量相當(dāng)于10ml口服懸液劑。
[0167]制備: 將Rhodigel懸浮在乙醇中；然后將本發(fā)明化合物加入到所得懸浮液中。在攪拌下加入 水。將所述混合物攪拌約6小時(shí)直到Rhodigel的溶脹完全。
[0168] 用于口服給藥的溶液劑： 組成： 500mg本發(fā)明的化合物、2. 5g聚山梨酸酯和97g聚乙二醇400。100mg本發(fā)明化合物 的單一劑量相當(dāng)于20g口服溶液劑。
[0169]制備: 在攪拌下，將本發(fā)明的化合物懸浮于聚乙二醇和聚山梨酸酯的混合物中。持續(xù)攪拌操 作直至本發(fā)明的化合物完全溶解。
[0170] i.v.溶液齊1丨： 將本發(fā)明的化合物以低于飽和溶解度的濃度溶解于生理上可接受的溶劑(例如等滲生 理鹽水、5%葡萄糖溶液和/或30%PEG400溶液）中。將該溶液無菌過濾，并裝入無菌且無 致熱原的注射容器中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 具有以下系統(tǒng)命名和結(jié)構(gòu)式（I)的化合物：2-{5-氟-l-[(3-氟吡啶-2-基）甲 基]-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5_甲基-5-(三氟甲基）-4-[(3,3,3_三氟丙基） 氨基]-5, 7-二氫-6H-吡咯并[2, 3-d]嘧啶-6-酮及其鹽類、溶劑合物和鹽類的溶劑合物。2. 式⑴的化合物的對(duì)映異構(gòu)體，其具有以下系統(tǒng)命名和結(jié)構(gòu)式（Ι-A): (5R) -2- {5-氟-1- [ (3-氟吡啶-2-基）甲基]-1H-吡唑并[3, 4-b]吡啶-3-基} -5-甲 基-5_ (二氣甲基）_4_ [ (3, 3, 3-二氣丙基）氨基]-5, 7-二氫-6H-R比略并[2, 3_d]啼 啶-6-酮及其鹽類、溶劑合物和鹽類的溶劑合物。3. 式⑴的化合物的對(duì)映異構(gòu)體，其具有以下系統(tǒng)命名和結(jié)構(gòu)式（I-B): (5S) -2- {5-氟-1- [ (3-氟吡啶-2-基）甲基]-1H-吡唑并[3, 4-b]吡啶-3-基} -5-甲 基-5_ (二氣甲基）_4_ [ (3, 3, 3-二氣丙基）氨基]-5, 7-二氫-6H-R比略并[2, 3_d]啼 啶-6-酮及其鹽類、溶劑合物和鹽類的溶劑合物。4.用于制備如權(quán)利要求1中所定義的式（I)化合物的方法，其特征在于 在惰性溶劑中使用亞硝酸異戊酯和鹵素等價(jià)物將式（II)的化合物轉(zhuǎn)化為式（III)的化合物然后在惰性溶劑中，任選在合適的堿的存在下，使式（III)的化合物與式（IV)的化合 物反應(yīng)以獲得式（I)的化合物和任選將得到的式（I)的化合物任選地用合適的（i)溶劑和/或（ii)酸或堿轉(zhuǎn)化為 其溶劑合物、鹽類和/或鹽類的溶劑合物。5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，將式（I)的化合物分離為其對(duì)映異構(gòu)體。6. 如權(quán)利要求1、2或3中所述定義的式（I)、（Ι-A)或（I-B)的化合物，其用于治療和 /或預(yù)防疾病。7. 如權(quán)利要求1、2或3中所述定義的式（I)、（Ι-A)或（I-B)的化合物用于制備治療 和/或預(yù)防心力衰竭、心絞痛、高血壓、肺動(dòng)脈高壓、局部缺血、血管疾病、腎功能衰竭、血栓 栓塞病癥、纖維性病癥和動(dòng)脈硬化的藥物的用途。8. 如權(quán)利要求1、2或3中所述定義的式（I)、（Ι-A)或（I-B)的化合物，其用于治療和 /或預(yù)防心力衰竭、心絞痛、高血壓、肺動(dòng)脈高壓、局部缺血、血管疾病、腎功能衰竭、血栓栓 塞病癥、纖維性病癥和動(dòng)脈硬化的方法中。9. 藥物，包括如權(quán)利要求1、2或3中所述定義的式（I)、（Ι-A)或（I-B)的化合物與惰 性、無毒、藥學(xué)上適合的輔劑的組合。10. 藥物，包括如權(quán)利要求1、2或3中所述定義的式（I)、（Ι-A)或（I-B)的化合物與 另外的選自以下組的活性化合物的組合：有機(jī)硝酸酯、NO供體、cGMP-PDE抑制劑、具有抗血 栓活性的試劑、降血壓試劑和改變脂類代謝的試劑。11. 根據(jù)權(quán)利要求9或10的藥物，其用于治療和/或預(yù)防心力衰竭、心絞痛、高血壓、肺 動(dòng)脈高壓、局部缺血、血管疾病、腎功能衰竭、血栓栓塞病癥、纖維性病癥和動(dòng)脈硬化。12. 在人類和動(dòng)物中使用有效量的如權(quán)利要求1、2或3中所述定義的式（I)、（Ι-A)或 (I-B)的至少一種化合物或如權(quán)利要求9至11任一項(xiàng)中所定義的藥物以治療和/或預(yù)防心 力衰竭、心絞痛、高血壓、肺動(dòng)脈高壓、局部缺血、血管疾病、腎功能衰竭、血栓栓塞病癥、纖 維性病癥和動(dòng)脈硬化的方法。
【專利摘要】本發(fā)明涉及新型三氟甲基取代的稠合嘧啶類、其制備方法、其單獨(dú)或組合用于治療和/或預(yù)防疾病的用途，以及涉及其制備用于治療和/或預(yù)防疾病，特別是用于治療和/或預(yù)防心血管疾病的藥物的用途。
【IPC分類】C07D519/00, A61P9/10, A61K31/519
【公開號(hào)】CN105308055
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480011911
【發(fā)明人】M.福爾曼, J-P.施塔施, G.雷德利希, D.朗, A.瓦卡洛波洛斯, F.旺德, A.特施特根
【申請(qǐng)人】拜耳制藥股份公司
【公開日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2014年2月25日
【公告號(hào)】CA2902993A1, EP2961755A1, US9266871, US20140249168, WO2014131760A1