含有非糖基化Fc的多肽的制作方法
【專利說明】含有非糖基化Fc的多肽
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2013年3月14日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)序列第61/784, 669號(hào)的權(quán)益。 上述申請(qǐng)以引用方式并入本文中。
[0003]序列表的引用
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[0005]背景
[0006] IL-2結(jié)合三種跨膜受體亞單位：IL-2R β和IL-2R γ，兩者在IL-2結(jié)合時(shí)一起活 化細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)事件；以及⑶25(IL-2Ra)，其用來穩(wěn)定IL-2和IL-2R0 γ之間的相互 作用。IL-2Rf3 γ遞送的信號(hào)包括ΡΙ3激酶、Ras-MAP激酶和STAT5途徑的那些信號(hào)。
[0007] T細(xì)胞需要表達(dá)⑶25來響應(yīng)通常存在于組織中的低濃度IL-2。表達(dá)⑶25的T細(xì) 胞包括抑制自體免疫炎癥所必需的F0XP3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）以及被活化來表達(dá)CD25 的F0XP3-T細(xì)胞兩者。F0XP3-⑶25+T效應(yīng)細(xì)胞（Teff)可為⑶4+或⑶8+細(xì)胞，兩者均可促 成炎癥、自體免疫、器官移植排斥或移植物抗宿主疾病。IL-2刺激的STAT5信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于正 常T-reg細(xì)胞的生長和存活以及F0XP3高表達(dá)至關(guān)重要。
[0008]在共同擁有的W0 2010/085495中，我們描述了用IL-2突變蛋白來優(yōu)先擴(kuò)增或者 刺激Treg細(xì)胞。當(dāng)施用給受試者時(shí)，Treg細(xì)胞的效應(yīng)可用于治療炎性疾病和自體免疫疾 病。盡管其中所述的IL-2突變蛋白可用于在體內(nèi)相比于Treg細(xì)胞優(yōu)先擴(kuò)增Teff細(xì)胞，但 期望產(chǎn)生對(duì)人治療劑而言具有最佳屬性的IL-2突變蛋白。
[0009]概述
[0010]本文描述的是IL-2突變蛋白，其適于高產(chǎn)率生產(chǎn)性并具有優(yōu)化的藥理學(xué)活性。在 嘗試生產(chǎn)示例性IL-2突變蛋白基人治療劑的過程中，出現(xiàn)多個(gè)出乎意料且不可預(yù)見的觀 察結(jié)果。本文所述的IL-2突變蛋白是所述嘗試的結(jié)果。
[0011] 本文所述的IL-2突變蛋白對(duì)IL-2具有最小數(shù)量的改變，從而減少了產(chǎn)生抗IL-2 突變蛋白和/或內(nèi)源性IL-2的免疫應(yīng)答的可能性，但仍維持Treg的優(yōu)先擴(kuò)增和活化。此 外，在某些實(shí)施方案中，當(dāng)施用給受試者時(shí)，IL-2突變蛋白與增加血清半衰期的分子（例如 抗體Fc)融合。IL-2突變蛋白具有短的血清半衰期（對(duì)于皮下注射為3至5小時(shí)）。本文 所述的示例性IL-2突變蛋白Fc融合物在人體內(nèi)的半衰期為至少1天、至少3天、至少5天、 至少10天、至少15天、至少20天或至少25天。對(duì)IL-2突變蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)的這種效 應(yīng)允許IL-2突變蛋白治療劑可以降低或較低的頻率給藥。
[0012] 此外，在產(chǎn)生藥物大分子時(shí)，必須考慮大量產(chǎn)生大分子的能力，使聚集最小化并且 使分子的穩(wěn)定性最大化。IL-2突變蛋白Fc融合分子展示出此類屬性。
[0013]另外，在某些實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白Fc融合蛋白含有IgGIFc區(qū)。當(dāng)期望消除 IgGl (例如ADCC活性）的效應(yīng)子功能時(shí)，發(fā)現(xiàn)297位處天冬酰胺向甘氨酸的突變（N297G ; EU編號(hào)方案）與導(dǎo)致非糖基化IgGl的其它突變相比可提供極大改善的純化效率以及生物 物理特性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將半胱氨酸工程改造到Fc中以允許存在二硫鍵，這增加 了含有非糖基化Fc分子的穩(wěn)定性。非糖基化Fc的有效性超過IL-2突變蛋白Fc融合范圍。 因此，本文提供了含有Fc的分子、Fc融合物和抗體，其包含N297G取代以及一個(gè)或多個(gè)額 外殘基對(duì)半胱氨酸的任選取代。
[0014]本發(fā)明的另一個(gè)方面包括糖基化肽接頭。適于N-非糖基化的優(yōu)選接頭肽包括 GGNGT(SEQ ID N0:6)或YGNGT(SEQ ID N0:7)。
[0015]附圖簡述
[0016]圖1:在短期刺激測(cè)定時(shí)，通過與IgG-Fc的C端融合的均二聚未以降低的效能并 以對(duì)CD25的高親和力來改變IL-2突變蛋白的活性。
[0017]圖2A和圖2B:測(cè)試具有所示突變并與Fc-異源二聚體一側(cè)的C端融合的IL-2突 變蛋白刺激T細(xì)胞中STAT5磷酸化的能力。這些突變蛋白還包含三個(gè)對(duì)⑶25賦予高親和 力的突變（V69A、N71R、Q74P)。將它們的活性與不具有Fc融合物的IL-2的三種形式（開 符號(hào)）比較：WT IL-2、HaWT(對(duì)CD25的高親和力）（N29S、Y31H、K35R、T37A、K48E、V69A、 N71R、Q74P)和HaD(對(duì)CD25的高親和力以及減小的信號(hào)傳導(dǎo)活性）（N29S、Y31H、K35R、 T37A、K48E、V69A、N71R、Q74P、N88D)。顯示出被門控F0XP3+CD4+和F0XP3-CD4+T細(xì)胞的磷 酸-STAT5響應(yīng)。
[0018]圖3 :T細(xì)胞亞群響應(yīng)于與Fc-異源二聚體融合的IL-2突變蛋白的滴定的增殖。將 融合蛋白的活性與不具有Fc融合物的IL-2的三種形式比較（開符號(hào)）：WT IL-2、HaWT(對(duì) CD25的高親和力）（N29S、Y31H、K35R、T37A、K48E、V69A、N71R、Q74P)和HaD(對(duì)CD25的高 親和力以及減小的信號(hào)傳導(dǎo)活性）（N29S、Y31H、K35R、T37A、K48E、V69A、N71R、Q74P、N88D)
[0019]圖4 :NK細(xì)胞響應(yīng)于與Fc-異源二聚體融合的IL-2突變蛋白的滴定的增殖。將融 合蛋白的活性與不具有Fc融合物的IL-2的三種形式比較（開符號(hào)）：WT IL-2、HaWT(對(duì) CD25的高親和力）（N29S、Y31H、K35R、T37A、K48E、V69A、N71R、Q74P)和HaD(對(duì)CD25的高 親和力以及減小的信號(hào)傳導(dǎo)活性）（N29S、Y31H、K35R、T37A、K48E、V69A、N71R、Q74P、N88D)
[0020] 圖5 :T細(xì)胞亞群響應(yīng)于與Fc-同源二聚體N297G融合的IL-2突變蛋白的滴定的 增殖。將Fc突變蛋白的活性與WT IL-2(開環(huán)）和Fc.WT (閉環(huán)）比較。賦予對(duì)CD25高親 和力的突變（HaMutl)為V69A和Q74P。
[0021] 圖6 :NK細(xì)胞響應(yīng)于與Fc-同源二聚體N297G融合的IL-2突變蛋白的滴定的增 殖。將Fc突變蛋白的活性與WT IL-2 (開環(huán)）和Fc. WT (閉環(huán)）比較。
[0022] 圖7A和圖7B :不具有賦予對(duì)CD25的高親和力的突變的Fc. IL-2突變蛋白促進(jìn)人 源化小鼠中Treg擴(kuò)增和F0XP3上調(diào)。
[0023]圖8 :Fc. IL-2突變蛋白的低周劑量（每只動(dòng)物0. 5 μg)促進(jìn)人源化小鼠中Treg 擴(kuò)增和F0XP3上調(diào)，相對(duì)于Fc. N88D和Fc. WT，觀察到Fc. V91K具有更好的活性。
[0024]圖9 :Fc. V91K和Fc. N88D通過與CD25締合而存留于活化的T細(xì)胞的表面上。
[0025]優(yōu)選實(shí)施方案詳述
[0026]本文中所用的章節(jié)標(biāo)題僅用于組織目的且不應(yīng)理解為對(duì)所述主題進(jìn)行限制。本說 明書主體內(nèi)所引用的所有參考文獻(xiàn)全文以引用方式明確并入。
[0027]來對(duì)于重組DNA、寡核苷酸合成、組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化、蛋白質(zhì)純化等可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。 可實(shí)施根據(jù)生產(chǎn)廠家的說明書或者本領(lǐng)域通常使用的或者本發(fā)明所述的酶反應(yīng)和純化技 術(shù)。酶促反應(yīng)及純化技術(shù)可根據(jù)制造商說明書來實(shí)施，或以本領(lǐng)域內(nèi)常用方法來實(shí)施，或如 本文所述來實(shí)施。參見，例如Sambrook等，2001，MolecularCloning:A LaboratoryManuel， 第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，cold SpringHarbor，Ν· Υ·，其出于任何目的 以引用方式并入本文。除非提供具體定義，否則結(jié)合本文所述分析化學(xué)、有機(jī)化學(xué)及醫(yī)學(xué)及 藥物化學(xué)使用的命名及其實(shí)驗(yàn)室程序以及技術(shù)使用的命名為本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)熟知且常用的 術(shù)語。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可用于化學(xué)合成、化學(xué)分析、藥物制備、配制和遞送以及患者治療。
[0028] IL-2
[0029]本文所述的IL-2突變蛋白為野生型人IL-2的變體。如本文所用，"野生型人 IL-2"、"野生型IL-2"或"WT IL-2"應(yīng)意味著具有以下氨基酸序列的多肽：
[0030] APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEV LNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFXQSIISTLT
[0031]其中X為C、S、V或A(SEQIDN0:2)。
[0032]變體可在野生型IL-2氨基酸序列內(nèi)包含一個(gè)或多個(gè)取代、缺失或插入。殘基在本 文中通過一個(gè)字母氨基酸代碼接著IL-2氨基酸位置來指定，例如K35是SEQIDN0:2在35 位處的賴氨酸殘基。取代在本文中通過一個(gè)字母氨基酸代碼接著IL-2胺基酸位置接著取 代一個(gè)字母氨基酸代碼來指定，例如K35A為SEQIDN0:2的35位處的離胺酸殘基經(jīng)丙胺酸 殘基的取代。
[0033]IL-2突奪蛋白
[0034]本文中提供優(yōu)先刺激T調(diào)節(jié)（Treg)細(xì)胞的人IL-2突變蛋白。如本文所用，"優(yōu)先 刺激T調(diào)節(jié)細(xì)胞"是指相對(duì)于⑶3+FoxP3-T細(xì)胞，突變蛋白優(yōu)先促進(jìn)⑶3+FoxP3+T細(xì)胞的增 殖、存活、活化和/或功能。測(cè)量優(yōu)先刺激Treg能力的方法可通過外周血白細(xì)胞的流式細(xì)胞 術(shù)來測(cè)量，其中觀察F0XP3+⑶4+T細(xì)胞在總⑶4+T細(xì)胞中的百分比的增加、F0XP3+⑶8+T細(xì) 胞在總⑶8+T細(xì)胞中的百分比的增加，F(xiàn)0XP3+T細(xì)胞相對(duì)于NK細(xì)胞的百分比的增加和/或 相對(duì)于在其它T細(xì)胞上的⑶25表達(dá)增加F0XP3+T細(xì)胞表面⑶25表達(dá)水平的更大的增加。 Treg細(xì)胞的優(yōu)先生長也可通過，可根據(jù)去甲基化F0XP3啟動(dòng)子DNA ( S卩，Treg特異性去甲基 化區(qū)域或TSDR)相對(duì)于從全血提取的DNA中的去甲基化CD3基因的增加的呈現(xiàn)來測(cè)定，如 通過來自亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)產(chǎn)物測(cè)序來檢測(cè)（J. Sehouli 等，2011，Epigenetics 6:2,236-246)。
[0035]優(yōu)先刺激Treg細(xì)胞的IL-2突變蛋白使受試者或外周血樣中的⑶3+FoxP3+T細(xì) 胞相對(duì)于⑶3+FoxP3-T細(xì)胞的比率增加至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60%、至少 70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少150%、至少200%、至少300%、至少400%、至 少500 %、至少600 %、至少700 %、至少800 %、至少900 %或至少1000%。
[0036]優(yōu)選的IL-2突變蛋白包括但不限于包含SEQIDN0:2中所示氨基酸序列內(nèi)的 V91K或N88D取代的IL-2突變蛋白。示例性IL-2突變蛋白在SEQIDN0:1中示出。特別 優(yōu)選的是SEQIDN0:1中所示的包含C125A取代的氨基酸序列。盡管減少野生型IL-2序 列的其它突變的數(shù)量是有利的，本發(fā)明包括除V91K或N88D取代之外也具有截短或額外插 入、缺失或取代的IL-2突變蛋白，前提條件是所述突變蛋白維持優(yōu)先刺激Treg的活性。因 此，實(shí)施方案包括下述IL-2突變蛋白：其優(yōu)先刺激Treg細(xì)胞并包含與SEQIDN0:2中所 示氨基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的V91K或N88D的氨基酸序列。在特別優(yōu)選 的實(shí)施方案中，此類IL-2突變蛋白包含與SEQ ID N0:2中所示氨基酸序列具有至少90%、 至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或 至少99 %同一性的氨基酸序列。
[0037]關(guān)于氨基酸序列，序列同一性和/或相似性可使用本領(lǐng)域所知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù) 來測(cè)定，包括但不限于Smith和Watermanl981，Adv. Appl. Math. 2:482的局部序列 同一性算法、Needleman和Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443的序列同一性比對(duì)算 法、Pearson和Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 85:2444的相似性方法研 究，這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)施方式（Wisconsin Genetics軟件包，Genetics Computer Group, 575Science Drive, Madison, Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)、Devereux 等，1984，Nuc 1. AcidRes. 12:387-395描述的最佳擬合序列程序，優(yōu)選使用默認(rèn)設(shè)置或 通過檢測(cè)。優(yōu)選地，通過FastDB基于以下參數(shù)計(jì)算百分比同一性：錯(cuò)配罰分1;空位罰 分1;空位開放罰分0.33;和聯(lián)接罰分30，"Current Methods in Sequence Comparison and Analysis, "Macromolecule Sequencing and Synthesis, SelectedMethods andApplications，第127-149頁（1988)，Alan R.Liss, Inc.
[0038]一個(gè)可用算法的實(shí)例為PILEUP。PILEUP使用漸進(jìn)式成對(duì)比對(duì)從一組相關(guān)序列創(chuàng) 建多個(gè)序列比對(duì)。其也可繪制用于創(chuàng)建所述比對(duì)的顯示聚類關(guān)系的樹狀圖。PILEUP采用 Feng&Doolittle，1987, J. Mol. Evol. 35:351-360的漸進(jìn)式比對(duì)方法的簡化形式；所述方法 與Higgins和Sharp，1989, CABI0S 5:151-153所述的方法類似。可用的PILEUP參數(shù)包括 3. 00的默認(rèn)缺口權(quán)重、0. 10的默認(rèn)缺口長度和加權(quán)末端缺口。
[0039]另一可用算法的實(shí)例為BLAST算法，描述于：Altschul等，1990, J. Mol. Biol. 215:403-410 ;Altschul等，1997，Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 ;以及Karin等， 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90:5873-5787。特別有用的BLAST程序?yàn)閃U-BLAST-2 程序，其得自Altschul等，1996，Methods in Enzymology 266:460-480。WU-BLAST-2使用 若干檢索參數(shù)，其中大部分檢索參數(shù)設(shè)定為默認(rèn)值?？烧{(diào)節(jié)參數(shù)以下面的值設(shè)定：重疊跨 度=1，重疊分?jǐn)?shù)=0. 125,代碼閾值（T) = II。HSP S和HSP S2參數(shù)為動(dòng)態(tài)值，并且通過 程序本身根據(jù)特定序列的組成和被檢索的關(guān)注序列所針對(duì)的特定數(shù)據(jù)庫的組成來確立；然 而，可調(diào)節(jié)所述值來提高靈敏性。
[0040]另外的可用算法為空位BLAST，如Altschul等，1993，Nucl. Acids Res. 25:3389-3402所報(bào)道?？瘴籅LAST使用BL0SUM-62取代得分：閾值T參數(shù)設(shè)定為9;觸 發(fā)無缺口延伸的兩命中點(diǎn)法（two-hit method)，空位長度k要求支出10+k的代價(jià)；XU設(shè)定 為16,以及Xg針對(duì)數(shù)據(jù)庫檢索階段設(shè)定為40并且針對(duì)輸出階段設(shè)定為67?？瘴槐葘?duì)通過 對(duì)應(yīng)于約22比特的得分來觸發(fā)。
[0041]雖然引入氨基酸序列變化的位點(diǎn)或區(qū)域可以預(yù)定，但突變本身不需要預(yù)定。例如， 為了優(yōu)化指定位點(diǎn)的突變的性能，可在目標(biāo)密碼子或區(qū)域處進(jìn)行隨機(jī)誘變并且針對(duì)期望活 性的最佳組合篩選表達(dá)的IL-2突變蛋白。在具有已知序列之DNA中的預(yù)定位點(diǎn)處進(jìn)行取 代突變的技術(shù)為人們所熟知，例如，M13引物誘變和PCR誘變。例如，可使用本文所述的測(cè) 定方法來篩選突變體。
[0042]氨基酸取代通常為單一殘基；插入通常接近約一（1)至約二十（20)個(gè)氨基酸殘 基，但可容許大得多的插入。缺失的范圍在約一（1)至約二十（20)個(gè)氨基酸殘基的范圍內(nèi)， 但在某些情況下缺失可大得多。
[0043] 取代、缺失、插入或者其任何組合可用于達(dá)成最終衍生物或變體。通常，對(duì)少數(shù)氨 基酸進(jìn)行這些變化以使分子的改變最小化，具體為抗原結(jié)合蛋白的免疫原性和特異性。然 而，在某些情況下可容許更大的改變。保守取代通常根據(jù)表1所示的以下圖表進(jìn)行。
[0044]表1
[0045]
[0046]通過選擇比表1中所示取代較不保守的取代來進(jìn)行功能或免疫學(xué)特性的實(shí)質(zhì)變 化。例如，可進(jìn)行更顯著影響以下性質(zhì)的取代：改變區(qū)域中的多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如α-螺 旋或片狀結(jié)構(gòu)；靶點(diǎn)處分子的電荷或疏水性；或側(cè)鏈容積。通常預(yù)期產(chǎn)生多肽性質(zhì)的 最大變化的取代為下述那些，其中（a)親水性殘基，（例如絲氨酰或蘇氨?；┤〈鸀槭杷?性殘基（例如亮氨酰基、異亮氨?；?、苯丙氨?；⒗i氨?；虮滨；ɑ蚪?jīng)其取代）； (b)半胱氨酸或脯氨酸取代為任何其它殘基（或經(jīng)其取代）；(c)具有正電性側(cè)鏈的殘基， (例如賴氨?；?、精氨?；蚪M氨?；〈鸀樨?fù)電性殘基取代（例如谷氨?；蛱於滨?基）（或經(jīng)其取代）；或（d)具有龐大側(cè)鏈的殘基（例如苯丙氨酸）取代為不具有側(cè)鏈的殘 基（例如甘氨酸）（或經(jīng)其取代）。
[0047]變體通常呈現(xiàn)與天然類似物相同的定性生物活性并將引發(fā)相同的免疫應(yīng)答，但變 體也可經(jīng)選擇以根據(jù)需要來改變IL-2突變蛋白的特性?；蛘?，變體可經(jīng)設(shè)計(jì)以使得IL-2 突變蛋白的生物活性得到改變。例如，糖基化位點(diǎn)可如本文中所論述來改變或去除。
[0048]具有延長的血清半衰期的IL-2突奪蛋白
[0049]由于本文中所提供的IL-2突變蛋白相比于（例如）Teff或NK細(xì)胞優(yōu)先擴(kuò)增 Treg，因此期望施用給患者時(shí)其安全性與野生型IL-2或PR0LEUKIN不同。與野生型IL-2 或PR0LEUKIN相關(guān)的副作用包括流感樣癥狀、發(fā)冷/僵直、關(guān)節(jié)痛、發(fā)燒、皮疹、瘙癢癥、注射 部位反應(yīng)、低血壓、痢疾、惡心、焦躁不安、混亂和抑郁。本文中所提供的IL-2突變蛋白可經(jīng) 改變以包括延長突變蛋白的血清半衰期的分子或與其融合，而不增加該半衰期延長可增加 患者中副作用或不良事件的可能性或強(qiáng)度的風(fēng)險(xiǎn)。此類具有延長的血清半衰期的突變蛋白 的皮下給藥可允許持久靶標(biāo)覆蓋以及較低全身性最大暴露（C_)。延長的血清半衰期可允 許突變蛋白的較低或較少頻率給藥方案。
[0050]本文提供的IL-2突變蛋白的血清半衰期可通過基本上任何本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法 來延長。此類方法包括改變IL-2突變蛋白的序列以包括與新生Fc γ受體結(jié)合或與具有延 長的血清半衰期的蛋白質(zhì)例如IgG或人血清白蛋白結(jié)合的肽。在其它實(shí)施方案中，IL-2突 變蛋白與賦予融合分子延長的半衰期的多肽融合。此類多肽包括IgG Fc或其它與新生的 Fey受體、人血清白蛋白結(jié)合的多肽，或與具有延長的血清半衰期的蛋白質(zhì)結(jié)合的多肽。在 優(yōu)選的實(shí)施方案中，IL-2突變蛋白與IgGFc分子融合。
[0051] IL-2突變蛋白可與IgGFc區(qū)的N端或C端融合。如實(shí)施例中所示，與IgGFc區(qū)的 C端融合與在IgGFc區(qū)的N端融合相比更大程度上保持了IL-2突變蛋白的活性。
[0052]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及二聚體，所述二聚體包含兩個(gè)通過融合IL-2突變蛋 白與抗體的Fc區(qū)產(chǎn)生的Fc-融合多肽。例如，可通過如下方式制備二聚體：將編碼融合蛋 白的基因融合物插入適當(dāng)表達(dá)載體中，在用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化過的宿主細(xì)胞中表達(dá)該基因 融合物，并使所表達(dá)的融合蛋白組裝成極為類似抗體的分子，隨后在Fc部分之間形成鏈間 鍵，由此得到二聚體。
[0053]如本文所使用，術(shù)語"Fc多肽"或"Fc區(qū)"包括源于抗體Fc區(qū)的多肽的天然和突 變蛋白形式。也包括含有促進(jìn)二聚化的鉸鏈區(qū)的此類多肽的截短形式。在某些實(shí)施方案 中，F(xiàn)c區(qū)包含抗體CH2和CH3域。連同延長的血清半衰期，包含F(xiàn)c部分的融合蛋白（和由 其形成的寡聚物）提供了有利于在蛋白A或蛋白G柱上經(jīng)由親和層析純化的優(yōu)點(diǎn)。優(yōu)選的 Fc區(qū)衍生自人IgG，其包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。本文中，F(xiàn)c中的特定殘基通過位置 來識(shí)別。所有Fc位置基于EU編號(hào)系統(tǒng)。
[0054]抗體的Fc部分的一個(gè)功能是當(dāng)抗體與其靶點(diǎn)結(jié)合時(shí)與免疫系統(tǒng)通信。這被稱為 "效應(yīng)子功能"。通信導(dǎo)致抗體依賴性細(xì)胞毒作用（ADCC)、抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用（ADCP) 和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用（⑶C)。ADCC和ADCP通過Fc和免疫系統(tǒng)細(xì)胞表面上的Fc 受體結(jié)合來介導(dǎo)。CDC通過Fc與補(bǔ)體系統(tǒng)的蛋白例如Clq結(jié)合介導(dǎo)。
[0055] IgG亞類介導(dǎo)效應(yīng)子功能的能力有所不同。例如，在介導(dǎo)ADCC和⑶C方面，IgGl 比IgG2和IgG4更優(yōu)異。因此，在不期望效應(yīng)子功能的實(shí)施方案中，可優(yōu)選IgG2Fc。然而， 已知含有IgG2Fc的分子相比于含有IgGIFc的分子，更難生產(chǎn)并且具有不太有吸引力的生 物物理屬性，例如較短的半衰期。
[0056]抗體的效應(yīng)子功能可通過在Fc中引入一個(gè)或多個(gè)突變來增加或降低。本發(fā)明 的實(shí)施方案包括IL-2突變蛋白Fc融合蛋白，其具有工程改造后增加效應(yīng)子功能的Fc(U. S. 7, 317, 091和Strohl，Curr. Opin. Biotech.，20:685-691，2009;兩者全文以引用方式并 入本文）。具有增加的效應(yīng)子功能的示例性IgGIFc分子包括具有以下取代的那些：
[0057] S239D/I332E
[0058] S239D/A330S/I332E
[0059] S239D/A330L/I332E
[0060] S298A/D333A/K334A
[0061] P247I/A339D
[0062] P247I/A339Q
[0063] D280H/K290S
[0064] D280H/K290S/S298D
[0065] D280H/K290S/S298V
[0066] F243L/R292