P/Y300L
[0067] F243L/R292P/Y300L/P396L
[0068] F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L
[0069] G236A/S239D/I332E
[0070] K326A/E333A
[0071] K326W/E333S
[0072] K290E/S298G/T299A
[0073] K290N/S298G/T299A
[0074] K290E/S298G/T299A/K326E
[0075] K290N/S298G/T299A/K326E
[0076]增加含有IgG Fc蛋白質(zhì)的效應子功能的另一個方法為通過減少Fc的巖藻糖基 化。從附接到Fc上的雙觸角復合型寡糖上去除核心巖藻糖極大地增加了ADCC效應子功能 而不改變抗原結(jié)合或CDC效應子功能。已知若干種減少或消除含有Fc分子例如抗體的巖藻 糖基化的方法。這些包括在哺乳動物細胞系中的重組表達，所述哺乳動物細胞系包括FUT8 敲除細胞系、變體CH0系Lecl3、大鼠雜交瘤細胞系YB2/0、包含特異性針對FUT8基因的小 干擾RNA的細胞系，和共表達β -1，4_N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶III和高爾基α-甘露糖苷 酶II的細胞系?；蛘?，含有Fc的分子可在非哺乳動物細胞例如植物細胞、酵母或原核細胞 例如大腸桿菌中表達。
[0077]在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，IL-2突變蛋白Fc融合蛋白包含工程改造后降低效 應子功能的Fc。具有降低的效應子功能的示例性Fc分子包括具有以下取代的那些：
[0078] N297A or N297Q(IgGl)
[0079] L234A/L235A(IgGl)
[0080] V234A/G237A(IgG2)
[0081] L235A/G237A/E318A (IgG4)
[0082] H268Q/V309L/A330S/A331S(IgG2)
[0083] C220S/C226S/C229S/P238S(IgGl)
[0084] C226S/C229S/E233P/L234V/L235A (IgGl)
[0085] L234F/L235E/P331S(IgGl)
[0086] S267E/L328F(IgGl)
[0087]已知人IgGl在N297 (EU編號系統(tǒng)）含有糖基化位點并且糖基化作用有助于IgGl 抗體的效應子功能。示例性IgGl序列提供于SEQ ID N0:3中。小組使N297發(fā)生突變以嘗 試制備非糖基化抗體。此類突變重點在于用生理化學性質(zhì)類似于天冬酰胺的氨基酸例如麩 酰胺酸（N297Q)或用模擬不具有極性基團的天冬酰胺的丙氨酸（N297A)取代N297。
[0088]如本文所用，"非糖基化抗體"或"非糖基化fc"是指Fc的297位處殘基的糖基化 狀態(tài)?？贵w或其他分子在一或多個其它位點處可含有糖基化但仍可被視為非糖基化抗體或 非糖基化Fc融合蛋白。
[0089]在我們嘗試制備IgGIFc無功能的效應子的過程中，發(fā)現(xiàn)人IgGl的氨基酸N297突 變?yōu)楦拾彼幔碞297G，提供了與其它氨基酸在其殘基上的取代相比，大大優(yōu)異的純化效率 和生物物理特性。參見實施例8。因此，在優(yōu)選的實施方案中，IL-2突變蛋白Fc融合蛋白包 含具有N297G取代的人IgGIFc。包含N297G取代的Fc可用于任何其中分子包含人IgGIFc 的背景中，并且不限于使用IL-2突變蛋白Fc融合的背景中。在某些實施方案中，抗體包含 具有N297取代的Fc。
[0090]包含具有N297G突變的人IgGIFc的Fc也可包含另外的插入、缺失和取代。在某 些實施方案中，人IgGIFc包含N297G取代并且與SEQIDN0:3中所示氨基酸序列具有至少 90 %同一'性、至少91 %同一'性、至少92 %同一'性、至少93 %同一'性、至少94%同一'性、至少 95%同一性、至少96%同一性、至少97%同一性、至少98%同一性或至少99%同一性。在 特別優(yōu)選的實施方案中，C端賴氨酸殘基被取代或缺失。含有N297G取代和C端賴氨酸缺 失的人IgGl的氨基酸序列在SEQIDN0:4中示出。
[0091]含有非糖基化IgGIFc的分子與含有糖基化IgGIFc的分子相比顯示出更低的穩(wěn)定 性。Fc區(qū)可進一步工程改造以增加非糖基化分子的穩(wěn)定性。在一些實施方案中，一個或多 個氨基酸被取代為半胱氨酸以形成呈二聚體狀態(tài)的二硫鍵。SEQ ID N0:3中所示的氨基酸 序列殘基V259、A287、R292、V302、L306、V323或1332可被半胱氨酸取代。在優(yōu)選的實施 方案中，特定的殘基對經(jīng)取代以使得其優(yōu)先彼此形成二硫鍵，從而限制或防止二硫鍵錯配 (scrambling)。優(yōu)選的對包括但不限于A287C和L306C、V259C和L306C、R292C和V302C以 及V323C和I332C。
[0092]本文提供其中殘基V259、A287、R292、V302、L306、V323或1332中的一個多個被半 胱氨酸取代的含有Fc的分子。優(yōu)選的含有Fc的分子包括A287C和L306C、V259C和L306C、 R292C和V302C或V323C和I332C取代的那些。
[0093]示例性含有Fc的分子包括：
[0094]具有N297G、A287C、L306C取代和C端K缺失的人IgGIFc
[0095] DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNCKT KPREEQYGSTYRVVSVCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPG (SEQ ID NO :39)
[0096]具有N297G、A259C、L306C取代和C端K缺失的人IgGIFc
[0097] DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPECTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYGSTYRVVSVCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHFALHNHYTQKSLSL SPG(SEQIDNO:40)
[0098]具有N297G、R292C、V302C取代和C端K缺失的人IgGIFc
[0099]DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPG(SEQIDNO:41)
[0100]具有N297G、A287C、V306C取代的人IgGIFc
[0101] DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNCkT KPREEQYGSTYRVVSVCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK(SEQ ID NO：42)
[0102] 具有N297G、V259C、L306C取代的人IgGIFc
[0103]DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPECTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYGSTYRVVSVCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG5FFLYSKLTVDK5RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK5LSL SPGK(SEQIDNO：43)
[0104]具有N297G、R292C、V302C取代的人IgGIFc
[0105]DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK(SEQIDNO：44)
[0106] 可對IgGIFc進行的其它突變包括有利于在含F(xiàn)c多肽中形成異源二聚體的那些。 在一些實施方案中，F(xiàn)c區(qū)經(jīng)工程改造以產(chǎn)生當在細胞中共表達時有利于兩個不同含F(xiàn)c多 肽鏈的異源二聚體形成的"凸起"和"孔洞"。U.S. 7, 695, 963。在其它實施方案中，F(xiàn)c區(qū)經(jīng) 改變以當在細胞中共表達時使用靜電牽引促進異源二聚體形成而阻礙兩個不同含F(xiàn)c多肽 的同源二聚體形成。W0 09/089, 004,其以引用的方式全文并入本文中。優(yōu)選的異源二聚體 Fc包括其中Fc的一條鏈含有D399K和E356K取代并且Fc的另一條鏈含有K409D和K392D 取代的那些。在其它實施方案中，F(xiàn)c的一條鏈含有D399K、E356K和E357K取代，并且Fc的 另一條鏈含有K409D、K392D和K370D取代。
[0107] 在某些實施方案中，IL-2突變蛋白Fc融合蛋白可有利地為單體的，即僅含有單一 IL-2突變蛋白分子。在此類實施方案中，融合蛋白的Fc區(qū)可包含一個或多個有利于異源二 聚體形成的突變。融合蛋白與Fc區(qū)共表達，所述Fc區(qū)具有與IL-2突變蛋白Fc融合多肽 中的那些交互的突變但缺乏IL-2突變蛋白。當兩個含有Fc的多肽形成異源二聚體時，所 得的蛋白質(zhì)僅包含單一IL-2突變蛋白。
[0108] 產(chǎn)生單體IL-2突變蛋白Fc融合蛋白的另一方法為融合IL-2突變蛋白和單體Fc， 即不會二聚化的Fc區(qū)。穩(wěn)定單體Fc包含阻止二聚化和穩(wěn)定單聚形式中分子的突變。優(yōu)選的 單體Fc公開于W0 2011/063348中，其全文以引用方式并入本文。在某些實施方案中，IL-2 突變蛋白Fc融合蛋白包含在392位和409位含有帶負電荷的氨基酸以及在Y349、L351、 L368、V397、L398、F405或Y407處的蘇氨酸取代的Fc。
[0109] 在某些實施方案中，IL-2突變蛋白Fc融合蛋白包含介于Fc和IL-2突變蛋白之間 的接頭。許多不同的接頭多肽為本領(lǐng)域所知并且可用于IL-2突變蛋白Fc融合蛋白的背景 中。在優(yōu)選的實施方案中，IL-2突變蛋白Fc融合蛋白包含一個或多個在Fc與IL-2融合 蛋白之間由GGGGS(SEQIDN0:5)、GGNGT(SEQIDN0:6)或YGNGT(SEQIDN0:7)組成的肽 的拷貝。在一些實施方案中，F(xiàn)c與IL-2融合蛋白之間的多肽區(qū)包括GGGGS(SEQIDN0:5)、 GGNGT(SEQIDN0:6)或YGNGT(SEQIDN0:7)的單個拷貝。如本文所示，接頭GGNGT(SEQ IDNO:6)或YGNGT(SEQIDNO: 7)在合適的細胞中表達時被糖基化并且此類糖基化可助于 穩(wěn)定呈溶液形式和/或體內(nèi)施用時的蛋白質(zhì)。因此，在某些實施方案中，IL-2突變蛋白融 合蛋白包含F(xiàn)c區(qū)與IL-2突變蛋白域之間的糖基化接頭。
[0110] 預期該糖基化接頭在放置于多肽的環(huán)境中時是有用的。本文所提供包含在多肽的 氨基酸序列中插入GGNGT(SEQIDN0:6)或YGNGT(SEQIDN0:7)或在多肽的氨基酸序列中 置換一個或多個氨基酸的多肽。在優(yōu)選的實施方案中，GGNGT(SEQIDN0:6)或YGNGT(SEQ IDN0:7)被插入多肽三級結(jié)構(gòu)的環(huán)中。在其它實施方案中，環(huán)的一個或多個氨基酸被 GGNGT(SEQIDN0:6)或YGNGT(SEQIDN0:7)所置換。
[0111]Fc的C端部分和/或IL-2突變蛋白的氨基端部分可包含一個或多個突變，所述 突變在哺乳細胞中表達時改變IL-2突變蛋白Fc融合蛋白的糖基化特性。在某些實施方案 中，IL-2突變蛋白還包含T3取代，例如T3N或T3A。IL-2突變蛋白還可包含S5取代，例如 S5T
[0112] IL-2突變蛋白和IL-2突變蛋白Fc融合蛋白的共價修飾包括于本發(fā)明的范圍內(nèi)， 并且通常（但不總是）為翻譯后修飾。例如，通過使IL-2突變蛋白或IL-2突變蛋白Fc融 合蛋白的特異性氨基酸殘基與能夠與選定側(cè)鏈或N端或C端殘基反應的有機衍生劑反應將 IL-2突變蛋白或IL-2突變蛋白Fc融合蛋白的共價修飾的若干類型引入分子中。
[0113] 使最常間的半胱氨酰殘基與α-鹵代乙酸鹽（和對應的胺，例如氯乙酸或氯乙酰 胺）反應，從而得到羧甲基或羧酰胺甲基衍生物。半胱氨酰殘基也衍生自與溴代三氟丙酮、 α_漠_(5-味Ρ坐基）丙酉愛、憐酉愛氣乙酉先酯、Ν-烷基馬來酉先亞月安、3-硝基_2_Ρ比啶基二硫 化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對氯汞基苯甲酸鹽、2-氯汞基-4-硝基酚或氯-7-硝基苯 并-2-氧雜-1，3-二唑的反應。
[0114] 組氨酰殘基衍生自與焦碳酸二乙酯在pH5. 5-7. 0下的反應，因為所述試劑對組 氨酰側(cè)鏈具有相對特異性。對溴苯酰甲基溴也是可用的；該反應優(yōu)選在0. 1M的二甲胂酸鈉 中在pH6. 0下進行。
[0115] 賴氨?；桶被藲埢c琥珀酸或其它羧酸酐反應。使用這些試劑的衍生化具有 逆轉(zhuǎn)賴氨酰殘基的電荷的效應。其它適于使含α-氨基的殘基衍生化的試劑包括酰亞胺 酯，諸如甲基吡啶亞胺甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氫化物；三硝基苯磺酸；〇-甲基異 脲；2, 4-戊二酮；以及與乙醛酸的轉(zhuǎn)氨酶催化反應。
[0116] 精氨酰殘基通過與一個或幾個常規(guī)試劑反應來修飾，這些試劑包括苯甲酰甲醛、 2, 3- 丁二酮、1，2-環(huán)己二酮和茚三酮。精氨酸殘基的衍生化由于胍官能團的高pKa而需要 反應在堿性條件下進行。此外，這些試劑可與賴氨酸的基團以及精氨酸ε-氨基反應。
[0117] 酪氨酰殘基的特異修飾已得到了廣泛的研究，其中尤其關(guān)注通過與芳族重氮化合 物或四硝基甲烷反應而向酪氨酰殘基中引入光譜標記。最常見的是，將Ν-乙?；溥蚝退?硝基甲烷分別用于形成ο-乙?；野滨Ｎ镔|(zhì)和3-硝基衍生物。酪氨酰殘基用1251或131I碘化來制備標記的蛋白質(zhì)以用于放射性免疫測定，上述氯胺T方法是適合的。
[0118] 羧基側(cè)基（天冬氨酰基或谷氨?；┩ㄟ^與碳二亞胺（R'一N=C=N-R'）反 應來選擇性地修飾，其中R和R'可任選地為不同的烷基基團，例如1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉 基_4_乙基）碳二亞胺或1-乙基_3_ (4-氮鐵-4, 4-二甲基戊基）碳二亞胺。此外，天冬 氨?；凸劝滨埢赏ㄟ^與銨離子反應而轉(zhuǎn)化成天冬酰胺酰殘基和谷氨酰胺酰殘基。
[0119] 利用雙官能劑的衍生化可用于使抗原結(jié)合蛋白與用于各種方法的水不溶性載體 基質(zhì)或表面交聯(lián)。常用的交聯(lián)劑包括例如1，1-雙（重氮乙?；?2-苯基乙烷、戊二醛、 N-羥基琥珀酰亞胺酯（例如與4-疊氮基水楊酸形成的酯）、同雙官能酰亞胺酯（包括二琥 珀酰亞氨基酯，諸如3, 3'-二硫代雙（琥珀酰亞氨基丙酸酯））以及雙官能馬來酰亞胺（諸 如雙-N-馬來酰亞胺基-1，8-辛烷）。諸如3-[(對疊氮苯基）二硫代]丙亞氨酸甲酯的衍 生化試劑產(chǎn)生在存在光的情況下能夠形成交聯(lián)的光可活化的中間體。或者，采用反應性水 不溶基質(zhì)諸如溴化氰活化的碳水化合物和反應性底物（例如，如在美國專利號3, 969, 287、 3, 691，016、4, 195, 128、4, 247, 642、4, 229, 537 和 4, 330, 440 中所述）進行蛋白固定。
[0120] 谷氨酰胺酰殘基和天冬酰胺酰殘基往往去酰胺化分別形成相應的谷氨酰殘基和 天冬氨酰殘基。或者，這些殘基在適度的酸性條件下去酰胺化。這些殘基的任一形式均落 在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0121] 其它修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨?；蛱K氨酰殘基的羥基的磷酸化， 賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈的α-氨基的甲基化（T.E.Creighton，Proteins:Structure andMolecularProperties，W.H.Freeman&Co.，SanFrancisco, 1983,第 79-86 頁），N端 胺的乙酰基化及任何C端羧基的酰胺化。
[0122] 包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)的IL-2突變蛋白或IL-2突變蛋白Fc融合蛋白的另一種 共價修飾形式包括改變蛋白質(zhì)的糖基化模式。如本領(lǐng)域中所知的，糖基化模式可取決于蛋 白質(zhì)的序列（例如，特定糖基化氨基酸殘基的存在與否，下面討論），或產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的 宿主細胞或生物體。特定表達系統(tǒng)將于下文中討論。
[0123]多肽的糖基化為N-連接或0-連接。N-連接是指碳水化合物部分與天冬酰胺酰 殘基的側(cè)鏈連接。三肽序列天冬酰胺酰-X-絲氨酸和天冬酰胺酰-X-蘇氨酸（其中X為除 脯氨酸外的任何氨基酸）是將碳水化合物部分酶促連接至天冬酰胺酰側(cè)鏈的識別序列。因 此，多肽中這些三肽序列的任一者的存在均會產(chǎn)生潛在糖基化位點。〇-連接糖基化是指糖 N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一者與羥氨基酸（最通常為絲氨酸或蘇氨酸），但也可 使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。
[0124] 宜通過改變氨基酸序列以使IL-2突變蛋白或IL-2突變蛋白Fc融合蛋白含有一 或多個上述三肽序列（對于N-連接糖基化位點）來將糖基化位點添加至IL-2突變蛋白或 IL-2突變蛋白Fc融合蛋白中?？赏ㄟ^將一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基添加至起始序列 或經(jīng)這些殘基取代來進行改變（對于0-連接糖基化位點而言）。為了方便起見，優(yōu)選通過 DNA水平的改變，特別是通過使編碼靶多肽的DNA在預選堿基處突變以使得生成將翻譯成 期望氨基酸的密碼子來改變IL-2突變蛋白或IL-2突變蛋白Fc融合蛋白氨基酸序列。
[0125] 增加IL-2突變蛋白或IL-2突變蛋白Fc融合蛋白上的碳水化合物部分的數(shù)量的 另一方式是通過糖苷與蛋白質(zhì)的化學或酶促偶聯(lián)。這些工序的優(yōu)點在于其不需要在宿主細 胞內(nèi)產(chǎn)生具有糖基化能力（針對N-連接糖基化和0-連接糖基化）的蛋白質(zhì)。根據(jù)所用偶 合模式，可將糖連接至（a)精氨酸和組氨酸、（b)游離羧基、（c)游離巰基（諸如半胱氨酸的 巰基）、（d)游離羥基（諸如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的羥基）、（e)芳族殘基（諸如苯丙 氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族殘基）或（f)谷氨酰胺?；孽０坊?。這些方法描述于1987 年9 月 11 日公開的TO87/05330 和Aplin和Wriston，1981，CRCCrit.Rev.Biochem·，第 259-306 頁。
[0126] 起始IL-2突變蛋白或IL-2突變蛋白Fc融合蛋白上存在的碳水化合物部分的去 除可以化學方式或以酶促方式完成?；瘜W去糖基化需要將蛋白質(zhì)暴露于化合物三氟甲磺 酸或等效化合物中。此處理會導致除連接糖（N-乙?；咸前坊騈-乙酰半乳糖胺）外的 大部分或所有糖裂解，同時保留多肽完整性?；瘜W去糖基化由Hakimuddin等，1987,Arch. Biochem.Biophys. 259:52 和由Edge等，1981，Anal.Biochem. 118:131 描述。可使用多 種內(nèi)切和外切糖苷酶來酶促裂解多肽上的碳水化合物部分如Thotakura等，1987,Meth. Enzymol. 138:350描述。可使用化合物衣霉素來防止?jié)撛谔腔稽c的糖基化如Duskin 等，1982,J.Biol.Chem. 257:3105描述。衣霉素阻斷蛋白質(zhì)-N-糖苷鍵的形成。
[0127]IL-2突變蛋白或IL-2突變蛋白Fc融合蛋白的另一共價修飾類型包括以美國專利 4, 640, 835 ;4, 496, 689 ;4, 301，144 ;4, 670, 417 ;4, 791，192 或 4, 179, 337 中所闡述的方式 將IL-2突變蛋白或IL-2突變蛋白Fc融合蛋白與各種非蛋白質(zhì)性聚合物（包括但不限于 各種多元醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯）連接。此外，可在IL-2突變蛋白或IL-2 突變蛋白Fc融合蛋白的各個位置處進行氨基酸取代以有利于添加聚合物例如PEG。因此， 本發(fā)明的實施方案包括PEG化的IL-2突變蛋白或IL-2突變蛋白Fc融合蛋白。相比于非 PEG化的蛋白質(zhì)，此類PEG化的蛋白質(zhì)可具有延長的半衰期和/或減小免疫原性。
[0128]編碼IL-2突奪蛋白和IL-2突奪蛋白Fc融合蛋白的多核苷酸
[0129] 本發(fā)明涵蓋編碼IL-2突變蛋白和IL-2突變蛋白Fc融合蛋白的核苷酸。本發(fā)明 的各方面包括編碼本文所述的氨基酸序列的多核苷酸變體（例如，由于簡并性）。在優(yōu)選的 實施方案中，由分離的核苷酸編碼的多肽為IL-2突變蛋白Fc融合蛋白的組分。
[0130] 對應于本文所述的氨基酸序列的核苷酸序列（其待用作核苷酸分離的探針或引 物或用作數(shù)據(jù)庫檢索的查詢序列）可從氨基酸序列通過"回譯"獲得?？刹捎檬熘木酆?酶鏈反應（PCR)程序來分離或擴增編碼IL-2突變蛋白和IL-2突變蛋白Fc融合蛋白的 DNA序列。采用界定DNA片段的組合的末端的寡核苷酸作為5'和3'引物。所述寡核苷酸 可另外含有限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點，以