突變蛋白或IL-2Fc融合蛋白在炎癥或自體免疫部位的局部活性。 實施例
[0205] 以下提供的實施例（實際的及預(yù)示性的）旨在示出本發(fā)明的具體實施方案或特 征，而不是為了限制其范圍。
[0206] 實施例1-減少賦予對⑶25高親和力的突變數(shù)
[0207]IL-2突變蛋白對⑶25具有升高的親和力且具有減少的通過IL-2R0γ的信號傳 導(dǎo)強度優(yōu)先促進Treg生長和功能。為了降低潛在的免疫原性，尋求實現(xiàn)對CD25高親和力所 需的最小突變數(shù)。IL-2與其三種受體（PDB代碼-2B5I)的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)顯示V69A及 Q74P是定位于與⑶25相互作用的螺旋結(jié)構(gòu)中。這可解釋V69A及Q74P通常在兩次針對高 CD25結(jié)合親和力的獨立IL-2誘變篩選中分離的原因（Rao等2005 ;Thanos等2006)。該實 施例探究了Rao等篩選中所鑒定的IL-2突變蛋白"2-4"的其它突變中何者對增加上文利用 單獨V69A及Q74P所觀測到的親和力最重要。通過流式細胞術(shù)針對與活化T細胞表面上的 ⑶25的結(jié)合篩選以下蛋白質(zhì)。所有構(gòu)建體也包括用于純化及檢測的C端FLAG及poly-His 標簽。特異性突變提供于括號中。
[0208]HaMutlD(V69A，Q74P，N88D，C125A)(SEQIDNO:8)
[0209] APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEA LNLAPSKNFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
[0210] HaMut2D(N30S，V69A，Q74P，N88D，C125A) (SEQ ID NO :9)
[0211] APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINSYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEA LNLAPSKNFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
[0212] HaMut3D(K35R，V69A，Q74P，N88D，C125A)(SEQIDNO:10)
[0213] APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPRLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEA LNLAPSKNFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
[0214]HaMut4D(T37A，V69A，Q74P，N88D，C125A)(SEQIDNO:11)
[0215] APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLARMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEA LNLAPSKNFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
[0216]HaMut5D(K48E，V69A，Q74P，N88D，C125A)(SEQIDNO:12)
[0217] APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPEKATELKHLQCLEEELKPLEEA LNLAPSKNFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
[0218]HaMut6D(E68D，V69A，Q74P，N88D，C125A)(SEQIDNO:13)
[0219] APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEDA LNLAPSKNFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
[0220] HaMut7D(N71R，V69A，Q74P，N88D，C125A)(SEQIDNO:14)
[0221] APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEA LRLAPSKNFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
[0222] HaMut8D(K35R，K48E，E68D，N88D，C125A)(SEQIDNO:15)
[0223]APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPRLTRMLTFKFYMPEKATELKHLQCLEEELKPLEDV LNLAQSKNFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
[0224]HaMut7D以與初始分離物2-4"（~200pM)幾乎相同的親和力結(jié)合⑶25,這指示突 變N71R能夠極大增加上文利用單獨V69A、Q74P所觀測到的親和力（HaMutlD，~2nM)。其 它構(gòu)建體具有與HaMutlD類似或略高于其的親和力，親和力僅略高于WTIL-2的HaMut8D 除外。
[0225] 實施例2-與IgGl-Fc域融合以實現(xiàn)具有改善的半衰期的IL-2突變蛋白
[0226] 為減少利用IL-2突變蛋白實現(xiàn)Treg富集所需的給藥頻率，評價IL-2與IgGl-Fc 域之間的各種融合物。Fc域包含點突變來消除IgGl介導(dǎo)的效應(yīng)子功能，例如靶細胞溶解。 我們的研究中使用的Fc效應(yīng)子功能突變?yōu)锳327Q、AlaAla(L234A+L235A)或N297G。由于 Treg選擇性IL-2突變蛋白的IL-2效能具有部分降低，因此以不會顯著影響IL-2R信號傳 導(dǎo)的方式使IL-2與Fc融合甚為重要。因此，測試IL-2突變蛋白的利用及不利用Fc融合 物的IL-2R活化。
[0227] 為測定通過Fc融合物的IL-2二聚化是否將因?qū)L-2R的增加的親合力而提高 IL-2R信號傳導(dǎo)強度，使較弱IL-2突變蛋白（haD5) (US20110274650)與Fc的氨基端融合， 通過GGGGS(SEQIDN0:5)接頭序列分開。此突變蛋白具有3種影響IL-2R信號傳導(dǎo)（E15Q、 H16N、N88D)的突變、8 種賦予對CD25 的高親和力（N29S、Y31H、K35R、T37A、K48E、V69A、N71R、 Q74P)的突變（Rao等，2005)和防止半胱氨酸錯配和聚集的C125S。以類似方式與融合Fc 完全消除haD5的生物活性，而增強其與細胞表面CD25的高親和力結(jié)合，很可能是由于因二 聚化而增加的親合力。
[0228] 也使IL-2突變蛋白與Fc異源二聚體的N-或C端融合，從而使得Fc二聚體的僅一 條鏈具有IL-2域。兩個不對稱Fc鏈之間的異源二聚體配對是通過一個Fc鏈上所引入的 賴氨酸與另一Fc鏈上所引入的天冬氨酸之間的靜電相互作用來促進。在一種構(gòu)型優(yōu)選的 情況下，使IL-2突變蛋白haD6與一個Fc鏈或另一鏈的N端融合，從而得到兩種稱為haD6. FcDD和haD6.FcKK的蛋白質(zhì)構(gòu)建體。我們也用一個或兩個GGGGS(SEQIDN0:5)接頭使突 變蛋白haMut7D和Fc-異源二聚體的C-端融合（FcKK(G4S)haMut7D,FcKK(G4S) 2haMut7D)。 在PSTAT5和T細胞增殖實驗中，IL-2突變蛋白haD6與Fc異源二聚體的N端的融合導(dǎo)致 相對于游離haD6損失部分活性。相比之下，haMut7D與Fc異源二聚體的C端利用一或兩 個GGGGS(SEQIDN0:5)連接體的融合不會改變haMut7D的效能。
[0229] 也探究了IL-2突變蛋白和Fc同源二聚體的C-端的融合。在T75組織培養(yǎng)燒瓶 中利用100ng/ml抗⑶3 (0KT3)以3億個細胞/100ml活化總PBMC。在培養(yǎng)的第3天，洗滌 細胞3次并靜置在新鮮培養(yǎng)基中3天。然后利用IL-2變體以在ΙρΜ至10nM之間的10X 劑量調(diào)節(jié)刺激細胞達50μ1的最終體積。使用BDphosflow緩沖液試劑盒測量STAT5磷酸 化的水平。簡而言之，添加lml的BD溶解/固定phosflow緩沖液以停止刺激。在37°C下 將細胞固定20分鐘并在冰上利用lxBDphosflowperm緩沖液透化，然后針對⑶4、⑶25、F0XP3及pSTAT5進行染色。
[0230] 如圖1中可見，突變蛋白haMutlD及haMut7D的生物活性不會因與Fc同源二聚體 的C端融合而改變。因此，IL-2的N端與Fc的C端之間的融合不會使IL-2突變蛋白的激 動劑活性受損，甚至在Fc. IL-2同源二聚體的背景中也如此。在這些構(gòu)建體中，使用C125A 突變代替C125S用于經(jīng)改善的制備。
[0231] 實施例3-調(diào)節(jié)IL-2突變蛋白效能以實現(xiàn)優(yōu)先的Treg生長
[0232] 初始IL-2突變蛋白組含有單獨N88D或N88D以及1種或2種影響IL-2R信號傳導(dǎo) 的額外突變。設(shè)計第二組突變蛋白，全部具有單一點突變，目的是鑒定具有與N88D系列類似或略較強效的激動作用的突變蛋白。基于預(yù)測的IL-2Ri3-相互作用的氨基酸（晶體結(jié) 構(gòu)，PDB代碼-2B5I)來鑒定一組24種信號傳導(dǎo)突變?；陬A(yù)測的在突變蛋白與IL-2R0 之間的結(jié)合自由能的降低選擇特定取代。采用EGAD計算算法（Handel' s Laboratory， University ofCalifornia, San Diego, USA)來計算結(jié)合自由能。突變蛋白的結(jié)合自由能 定義為Αμ (AG^- AGwt)。其中，μ( =0· 1，通常）是用于使結(jié)合親和力的預(yù)測 變化歸一化以當與實驗?zāi)芟啾葧r具有1的斜率的比例因子（Pokala和Handel2005)。解離 的自由能（AG)定義為復(fù)合物（AGge)和自由狀態(tài)（AGes)之間的能量差。針對每個取 代計算解離能AGmut。
[0233] 一組具有以下取（H16E、H16Q、L19K、D20R、D20K、D20H、D20Y、M23H、D84K、D84H、 S87Y、N88D、N88K、N88I、N88H、N88Y、V91N、V91K、V91H、V91R、I92H、E95K、E95R或E95I)的 IL-2突變蛋白被表達為與Fc異源二聚體的C端融合物形式。這些構(gòu)建體也含有用于高 CD25結(jié)合親和力的haMut7突變（V69A、N71R、Q74P)及用于有效折疊的C125A。
[0234] 在實施例2的T細胞STAT5磷酸化測定中針對效能篩選所述組，并且發(fā)現(xiàn)H16E、 D84K、V91N、V91K及V91R具有小于野生型IL-2且超過N88D的活性（圖2)。
[0235] H16E、D84K、V91N、V91K和V91R具有小于野生型IL-2并超過N88D的活性。
[0236] 也在T細胞及NK生長測定中測試所選突變蛋白。
[0237] 對于T-細胞測定，利用100ng 0KT3以3百萬個/毫升活化總PBMC。在第2天， 洗滌細胞3次并靜置在新鮮培養(yǎng)基中5天。然后用CFSE標記細胞，并在24孔板中以50萬 個/孔于含有IL-2的培養(yǎng)基中進一步培養(yǎng)7天，然后進行FACS分析。T細胞亞群的增殖以 CFSE稀釋（中值CFSE熒光）呈現(xiàn)于圖3中。
[0238] 對于NK-細胞測定，在96孔板中以10萬個/孔于含有IL-2的培養(yǎng)基中將MACS 分類的⑶16+NK細胞培養(yǎng)3天。在孵育的最后18小時期間每孔加入0. 5 μ Ci3的Η-胸苷。 結(jié)果在圖4中示出。
[0239] 突變體Η16Ε、D84K、V91N、V91K和V91R突變體能以與WT IL-2類似的程度刺激 Treg生長，但對其它Τ細胞的效力為約小10χ(圖3)，并且對ΝΚ細胞的效力為約小100χ(圖 4)〇
[0240] 設(shè)計單獨Fc. IL-2融合蛋白組，其中Fc異源二聚體與突變蛋白haMut7(V69A、 N71R、Q74P、C125A)之間的距離因一系列個別氨基酸截短而減少。
[0241] Fc. haMut7 Fc...TQKSLSLSPGKGGGGSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILN. . . haMut7(S EQ ID NO：22)
[0242]TrunclFc. . . TQKSLSLSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILN. . .haMut7(SEQIDNO：23)
[0243] Trunc2 Fc. · · TQKSLSLS-STKKTQLQLEHLLLDLQMILN. · · haMut7(SEQ ID NO :24)
[0244]Trunc3 Fc. . . TQKSLSLS-TKKTQLQLEHLLLDLQMILN. . .haMut7(SEQIDNO：25)
[0245]Trunc4 Fc. . . TQKSLSLS-KKTQLQLEHLLLDLQMILN. . .haMut7(SEQIDNO：26)
[0246]Trunc5 Fc. . . TQKSLSLS--KTQLQLEHLLLDLQMILN. . .haMut7(SEQIDNO：27)
[0247]Trunc6 Fc. . . TQKSLSLS-----TQLQLEHLLLDLQMILN. . .haMut7(SEQIDNO：28)
[0248]Trunc7 Fc. . . TQKSLSLS------QLQLEHLLLDLQMILN. . .haMut7(SEQIDNO：29)
[0249]Trunc8 Fc. . . TQKSLSL-------QLQLEHLLLDLQMILN. ··haMut7(SEQIDNO:30)
[0250]Truncl_Trunc4具有等于全長親本構(gòu)建體Fc.haMut7的效能，如圖2、3及4所闡 述通過STAT5磷酸化并通過T細胞及NK細胞增殖來測量。Trunc5和Trunc6刺激較弱反 應(yīng)，但相比于由N88D突變（haD及haMut7D)刺激的反應(yīng)較強且與由V91K刺激的反應(yīng)極為 類似Trunc7相比于N88D突變蛋白較弱，且Trunc8具有極少活性。然而，當測試對NK細胞 時，Trunc5和Trunc6為強于V91K的激動劑，這指示Treg選擇性更容易利用信號傳導(dǎo)突變 而非近側(cè)Fc域的空間位阻來實現(xiàn)。
[0251] 實施例4-Fc同源二聚體的背景中的高⑶25親和力突變
[0252] 賦予高CD25結(jié)合親和力的突變被認為是有利的，因為它們增加了高CD25T細胞的 趨向性，并且因為它們促進了長期CD25 : :IL-2突變蛋白締合和持久的信號傳導(dǎo)。然而，減 少突變數(shù)量可降低免疫原性潛力。N88D或V91K突變蛋白（具有及不具有haMutl高親和 力突變V69A及Q74P)表達為與Fc同源二聚體的C端的融合物形式并針對生物活性進行比 較。在PSTAT5的刺激測定中，同源二聚化相對于單體突變蛋白對信號強度沒有效應(yīng)。高親 和力突變V69A和Q74P的逆轉(zhuǎn)也不會影響pSTAT5信號傳導(dǎo)。在T細胞生長測定中，高親和 力突變降低了對常規(guī)CD4T細胞和CD8T細胞的活性但未降低調(diào)節(jié)T細胞的活性（圖5)。高 親和力突變也未改變NK細胞中的增殖反應(yīng)（圖6)。
[0253] 為了測定高親和力突變是否影響體內(nèi)T細胞響應(yīng)，我們利用Fc.IL-2突變蛋白融 合蛋白向人源化小鼠（利用人CD34+造血干細胞復(fù)原的NOD.SCID. 112rg裸小鼠）給藥并 監(jiān)測Treg擴增。對 7 周齡N0D.SCID.I12rg-裸（NSG)小鼠（JacksonLabs，BarHarbor， ME)輻照（180rad)并用94, 000個人胎肝臟⑶34+造血干細胞復(fù)原。在21周，基于嵌合百 分比的均等分布（通過PBL的流式細胞術(shù)測定）將小鼠分成6組，在第0天和第7天通過 皮下注射給予1μg的所示的Fc突變蛋白或PBS。在第11天，通過流式細胞術(shù)測定血液中 的T細胞亞群頻率。在每只動物1μg的低劑量下，高親和力突變不會改善Treg擴增超過 利用單獨N88D或V91K突變所觀察的情況（圖7)。
[0254] Treg擴增是選擇性的，這是由于F0XP3⑶4+T細胞不會增加相對于總外周血白細 胞（PBL，包括人Β和Τ細胞的混合物）及小鼠髓樣細胞的豐度。此外，在較高劑量時，高親 和力突變促進⑶25+F0XP3Τ細胞的增加，因此降低了Treg的選擇性。因此，在Fc同源二聚 體的背景中，認為高親和力突變對于促進優(yōu)化Treg生長并非必需的。
[0255] Fc. WT IgGlFc(N297G_delK)：：G4S：：hulL-2(C125A)(SEQ ID NO：16)
[0256] DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPG
[0257] GGGGS
[0258] APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEV LNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
[0259] Fc. haMutlV91K IgGIFc (N297G_delK)：：G4S：：hulL-2 (V69A, Q74P, V91K, C125A) (SEQ ID NO：17)
[0260] DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPG
[0261] GGGGS
[0262] APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEA LNLAPSKNFHLRPRDLISNINKIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
[0263] Fc. V91K IgGIFc(N297G_delK)：：G45：：hulL-2(V91K, C125A) (SEQ ID NO：18)
[0264] DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPG
[0265] GGGGS
[0266] APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEV LNLAQSKNFHLRPRDLISNINKIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
[0267] Fc.haMutlN88D IgGIFc (N297G_delK) : :G45 : :hulL-2(V69A，Q74P，N88D，C125A) (SEQ ID NO：19)
[0268] DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPG
[0269] GGGGS
[0270] APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEA LNLAPSKNFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
[0271] Fc. N88D IgGIFc(N297G_delK)：：G4S：：hulL-2(N88D, C125A) (SEQ ID NO：20)
[0272] DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPG
[0273] GGGGS
[0274] APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEV LNLAQSKNF