HLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
[0275] 實(shí)施例5-Fc. IL-2突變蛋白的持久細(xì)胞表面CD25締合
[0276] 人源化小鼠研究的意外結(jié)果是，盡管其信號(hào)傳導(dǎo)能力降低，但相對(duì)于Fc.WTIL-2 突變蛋白誘導(dǎo)更穩(wěn)健Treg富集。在1μg/小鼠的劑量下（圖7)和在0. 5μg/小鼠的較低 劑量下（圖8)觀察到相對(duì)于利用Fc.WT所見(jiàn)的更高的Treg富集和F0XP3上調(diào)。此增加的 體內(nèi)效能可能是由于T細(xì)胞消耗減少所致，從而使得更多Fc.IL-2突變蛋白可用于持久信 號(hào)傳導(dǎo)。
[0277] 然而，體外和體內(nèi)PK研究未能展示Fc.V91K或Fc.N88D相對(duì)于Fc.WT在來(lái)自經(jīng)活 化T細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液或來(lái)自給藥小鼠的血清中的顯著增加的持久性。由于Fc融合物 具有兩個(gè)IL-2突變蛋白域，因此增加的內(nèi)體循環(huán)可因?qū)D25的增加的親合力而導(dǎo)致持久 細(xì)胞表面締合。實(shí)際上，我們發(fā)現(xiàn)FC.V91K和FC.N88D比Fc.WT在融合蛋白的簡(jiǎn)短暴露后 更有效地存留在先前活化的T細(xì)胞的表面上（圖9)。
[0278] 利用100ng/ml 0KT3將原代PBMC預(yù)刺激2天。收集細(xì)胞，洗滌4次并在培養(yǎng)基中 靜置過(guò)夜。然后在37°C下使細(xì)胞與400pM Fc. IL-2-起脈沖30分鐘。脈沖后，在一次洗滌 后收獲TO的細(xì)胞，或用12ml溫培養(yǎng)基額外洗滌3次并培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)。為檢測(cè)細(xì)胞締合的 Fc. IL-2,用抗人IgG_FITC(Jackson Immunoresearch)和抗-CD25-APC對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。
[0279] 實(shí)施例6-融合序列優(yōu)化
[0280] 在小鼠臨床前研究中，我們的Fc.IL-2突變蛋白在完整的分子的血清濃度僅與人 Fc部分相比時(shí)顯示差別暴露，這指示循環(huán)人Fc分解代謝物。為了優(yōu)化我們的Fc.IL-2突變 蛋白體內(nèi)穩(wěn)定性和藥代動(dòng)力學(xué)，我們對(duì)融合序列修飾表征在體循環(huán)中和在穿過(guò)網(wǎng)狀內(nèi)皮系 統(tǒng)的循環(huán)期間其對(duì)Fc.IL-2突變蛋白的蛋白水解降解的影響。評(píng)價(jià)以下構(gòu)建體的體外和體 內(nèi)蛋白水解降解。
[0281] (Ala_Ala)_G4S... TQKSLSLSPGKGGGGSAPTSSSTKKTQLQ... ha7N88D(SEQ ID NO：31)
[0282] (N297G_delK)_G45... TQKSLSLSPG_GGGGSAPTSSSTKKTQLQ... halV91K(SEQ ID NO：32)
[0283] (N297G_KtoA)_MPT. · · TQKSLSLSPGA-APTSSSTKKTQLQ. · · halV91K(SEQ ID NO :33)
[0284] (N297G_KtoA)_MPA. ·· TQKSLSLSPGA-APASSSTKKTQLQ. ·· halV91K(SEQ ID NO :34)
[0285] 通過(guò)比較總?cè)薋c隨時(shí)間的濃度與完整Fc.IL-2突變蛋白隨時(shí)間的濃度的定量免 疫測(cè)定來(lái)測(cè)量穩(wěn)定性。通過(guò)西部印跡分析并利用抗IL-2和抗人Fc抗體、接著免疫捕獲分 解代謝物來(lái)驗(yàn)證Fc.IL-2突變蛋白的蛋白水解，并通過(guò)質(zhì)譜法來(lái)表征。來(lái)自體外和體內(nèi)樣 品的（Ala_Ala)_G4S的質(zhì)譜法表征鑒定Fc域的C端Lys為蛋白水解裂解位點(diǎn)。與具有C 端賴(lài)氨酸的Fc構(gòu)建體（(Ala_Ala)_G4S)相比，F(xiàn)c域（(N297G_delK)_G4S和（N297G_KtoA)_ AAPT)的C端賴(lài)氨酸的缺失或突變導(dǎo)致在37°C下在小鼠血清中的持久體外穩(wěn)定性。該持久 的體外血清穩(wěn)定性轉(zhuǎn)換為在小鼠中的較大暴露，如在Fc.IL-2突變蛋白血清濃度對(duì)時(shí)間曲 線下的面積（AUC)測(cè)量。缺乏C-端Fc賴(lài)氨酸的Fc.IL-2突變蛋白的此持久穩(wěn)定性也在來(lái) 自食蟹猴和人的血清中在體外觀察到。在37°C下IL-2的Thr-3至Ala的突變（(N297G_ KtoA)_AAPA)導(dǎo)致在小鼠血清中和在利用重組人組織蛋白酶D和L的單獨(dú)孵育中的降低 的體外穩(wěn)定性（與（N297G_Kt〇A)_AAPT相比）。此降低的體外血清穩(wěn)定性轉(zhuǎn)換為（N297G_ KtoA) _AAPA在小鼠體內(nèi)的較低暴露（AUC)(與（N297G_KtoA) _AAPT相比）。來(lái)自體外和體 內(nèi)樣品的（N297G_Kt〇A)_AAPA的分解代謝物的質(zhì)譜法表征鑒定IL-2突變蛋白域的Lys8 和Lys9為易于蛋白水解的殘基，這在（N297G_Kt〇A)_AAPT的等效樣品中未觀察到。在來(lái) 自食蟹猴和人的血清中體外觀察到（N297G_KtoA)_AAPA相對(duì)于（N297G_KtoA)_AAPT在37°C 下的降低的穩(wěn)定性。
[0286] 由于此區(qū)中糖基化的重要性并且為了潛在改善融合蛋白的制備性，改變?nèi)诤闲蛄?以促進(jìn)N-連接而非0-連接的糖基化，例如以下。
[0287]原始
[0288] IgGlFc(N297G_delK)：：G4S：：hulL-2(V91K, C125A)TQKSLSLSPGGGGGSAPTSSSTKK TQLQ(SEQ ID NO：32)
[0289]改奪后的
[0290] IgGlFc(N297G_delK)：：G4S：：hulL-2(T3N, V91K, C125A)TQKSLSLSPGGGGGSAPNSS STKKTQLQ(SEQ ID NO：35)
[0291] IgGlFc(N297G_delK)：：G4S：：hulL-2(T3N, SST, V91K, C125A)TQKSLSLSPGGGGGS APNSTSTKKTQLQ(SEQ ID NO：36)
[0292] IgGlFc(N297G_delK)：：GGNGT：：hulL-2(T3A, V91K, C125A)TQKSLSLSPGGGNGTAPA SSSTKKTQLQ(SEQ ID NO：37)
[0293] IgGlFc(N297G_delK)：：YGNGT：：hulL-2(T3A, V91K,C125A)TQKSLSLSPGYGNGTAPA SSSTKKTQLQ(SEQ ID NO：38)
[0294] 實(shí)施例7-食蟹猴PK/PD測(cè)定
[0295] 標(biāo)準(zhǔn)IL-2免疫刺激療法需要介于給藥周期間的休藥期（不暴露）來(lái)避免不期望 的副作用。Treg擴(kuò)增或刺激療法可需要具有對(duì)于Treg刺激足夠的持續(xù)谷藥物水平（血清 C_)但具有低于導(dǎo)致免疫活化的藥物水平的最大暴露（血清C_)的持久暴露。此實(shí)施例 展示半衰期延長(zhǎng)的突變蛋白在食蟹猴中用于經(jīng)延長(zhǎng)靶標(biāo)覆蓋（血清(：_)時(shí)維持最大暴露 (血清C_)低于預(yù)期對(duì)于促炎性免疫活化必需的藥物水平的給藥策略。
[0296]食蟹猴分四組（A-D)以Fc.V91K(IgGlFc(N297G_delK) : :G4S::hulL-2(V91K,C12 5A)給藥，其中三組（A-C)皮下給藥和一組（D)靜脈內(nèi)給藥。對(duì)于每一組，根據(jù)下文所概述 的給藥策略向四只首次用于生物實(shí)驗(yàn)的雄性食蟹猴給藥。延長(zhǎng)半衰期的突變蛋白的皮下 給藥可允許更大淋巴吸收，從而導(dǎo)致較低最大暴露（血清(：_)和/或更穩(wěn)健的藥理學(xué)反應(yīng) (Treg擴(kuò)增）。A組的給藥策略包括三個(gè)在第1周期的第0天、第2天和第4天的連續(xù)10微 克/千克劑量和在第14天的10微克/千克，從而允許與50微克/千克的較高初始劑量類(lèi) 似的持久靶標(biāo)覆蓋同時(shí)維持較低最大暴露（C_)。B組的給藥策略為在第0天家第14天給 藥的50微克/千克以供與A組比較。C組的給藥策略為在第0天和第28天給藥的50微 克/千克。允許確定持續(xù)Treg富集是否需要谷覆蓋或介于給藥周期間的休藥期是否有益。 靜脈內(nèi)給藥D組的給藥策略為在第0天以50微克/千克給藥，從而允許比較與皮下給藥的 最大暴露（血清_)和Treg富集差異。
[0297] 在以下時(shí)間點(diǎn)針對(duì)每一指定劑量組測(cè)量藥代動(dòng)力學(xué)（完整分子和總?cè)薋c的定 量免疫分析）、抗藥物抗體、流出可溶性⑶25和血清細(xì)胞因子（IL-1β、TNF-α、IFN-γ、 IL-10、IL-5、IL-4 和IL-13):
[0298]iM:給藥前（第一周期；劑量1)、48(給藥前第一周期；劑量2)、96(給藥前第一 周期；劑量 3)、100、104、120、168、216、264、336(給藥前第二周期）、340、344、360、408、456、 504、576、672、744、840 和 1008 小時(shí)。
[0299] B組:給藥前(第一周期）、4、8、24、72、120、168、240、336(給藥前第二周期）、340、 344、360、408、456、504、576、672、744、840 和 1008 小時(shí)。
[0300]C組:給藥前(第一周期）、4、8、24、72、120、168、240、336、408、504、672(給藥前第 二周期）、676、680、696、744、792、840、912、1008、1080 和 1176 小時(shí)。
[0301]D組:給藥前(第一周期）、0.25、1、4、8、24、72、120、168、240、336、408、504和672 小時(shí)。
[0302] 在以下時(shí)間點(diǎn)針對(duì)每一指定劑量組測(cè)量藥效學(xué)（外周血Treg、非調(diào)節(jié)CD4和CD8T 細(xì)胞以和NK細(xì)胞的免疫表型分型和計(jì)數(shù)）：
[0303]Ml·給藥前（第一周期；劑量1)、96 (給藥前第一周期；劑量3)、168、336 (給藥前 第二周期）、456和576小時(shí)。
[0304]B組:給藥前(第一周期）、120、240、336 (給藥前第二周期）、456和576小時(shí)。
[0305]C組:給藥前(第一周期）、120、240、672 (給藥前第二周期）、792和912小時(shí)。
[0306] 給藥前（第一周期）、120和240。
[0307] 針對(duì)所有動(dòng)物和劑量組給藥前和每個(gè)劑量組初始劑量后24小時(shí)評(píng)估血液學(xué)和臨 床化學(xué)。評(píng)價(jià)以下參數(shù)。
[0308]血液學(xué)：
[0309] ?白細(xì)胞計(jì)數(shù)（全微分和絕對(duì)微分）
[0310] ?紅細(xì)胞計(jì)數(shù)
[0311] 魯血紅蛋白
[0312] ?血細(xì)胞比容
[0313] ?紅細(xì)胞平均血紅蛋白，平均紅細(xì)胞容積，紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度（計(jì)算值）
[0314] ?絕對(duì)網(wǎng)織紅細(xì)胞
[0315] ?血小板計(jì)數(shù)
[0316] ?血細(xì)胞形態(tài)
[0317] ?紅細(xì)胞分布寬度
[0318] ?平均血小板體積
[0319]臨床化學(xué)：
[0320] 魯堿性磷酸酶
[0321] ?總膽紅素（如果總膽紅素超過(guò)lmg/dL，則使用直接膽紅素）
[0322] ?天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶
[0323] ?丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶
[0324] ·γ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶
[0325] ?尿素氮
[0326] ?肌酸酐
[0327] ?總蛋白
[0328] ?白蛋白
[0329] ?球蛋白和A/G(白蛋白/球蛋白）比率（計(jì)算值）
[0330] ?葡萄糖
[0331] ?總膽固醇
[0332] ?三甘油酯
[0333] ?電解質(zhì)（鈉、鉀、氯）
[0334] #|丐
[0335] ?磷
[0336] 實(shí)施例8-非糖基化IgGIFc
[0337] 天然存在的IgG抗體在重鏈（CH2)的恒定域2具有糖基化位點(diǎn)。例如，人IgGl抗 體的糖基化位點(diǎn)位于位置Asn297(EU編號(hào)）處。迄今，制備非糖基化抗體的策略涉和用在 物理-化學(xué)性質(zhì)方面類(lèi)似于Asn的氨基酸（例如Gin)或用模擬不具有極性基團(tuán)的Asn側(cè) 鏈的Ala殘基置換Asn殘基。此實(shí)施例展示用甘氨酸置換Asn(N297G)的益處。N297GFc 是具有更佳生物物理性質(zhì)和制備性屬性（例如在純化期間的回收）的非糖基化分子。
[0338]Fc片段和IgG抗體的多個(gè)已知晶體結(jié)構(gòu)的檢查揭示了在糖基化的環(huán)區(qū)段周?chē)⑻?別是在糖基化的位置Asn297處的相當(dāng)大的構(gòu)象柔性。在許多已知的晶體結(jié)構(gòu)中，Asn297適 于正向的主鏈二面角。Gly由于缺乏側(cè)鏈原子而具有高的適應(yīng)正向主鏈二面角的傾向性。 因此，基于此構(gòu)象和結(jié)構(gòu)原因，相比于N297Q或N297A，Gly可為Asn的較好置換。
[0339] 用Gly取代Asn297導(dǎo)致具有純化過(guò)程中更多改善的回收（或效率）和生物物理 特性的非糖基化分子。例如，來(lái)自蛋白質(zhì)A庫(kù)的回收百分比（最終產(chǎn)率）對(duì)于N297G突變 而言為82.6%，與對(duì)于吧970而言的45.6%和對(duì)于吧974而言的39.6%相比。5?即柱分 析揭示用N297Q和N297A突變蛋白更低的回收百分比，是因?yàn)橥衔卜澹@指示高分子量聚集 和/或錯(cuò)誤折疊物質(zhì)。在較大的2L規(guī)模運(yùn)行下再次證實(shí)此結(jié)果。
[0340] 在生物制藥行業(yè)中，針對(duì)降低分子不適用于大規(guī)模生產(chǎn)和純化的風(fēng)險(xiǎn)的多種屬性 來(lái)評(píng)價(jià)具有潛在大規(guī)模生產(chǎn)需求（例如可以藥物形式出售）的分子。在制備性評(píng)估中， N297G揭示對(duì)pH變化的穩(wěn)健性。N297G沒(méi)有聚集問(wèn)題；然而N297Q和N297A的聚集分別增 加20%和10%。盡管N297G具有更佳的制備性特性，但在所有測(cè)試其的功能測(cè)定中其與 N297Q和N297A類(lèi)似。例如，在ADCC測(cè)定中，N297G缺乏細(xì)胞毒性，這與N297Q和N297A類(lèi) 似。
[0341] 實(shí)施例9 -穩(wěn)定的非糖基化IgGIFc
[0342] 該實(shí)施例描述了通過(guò)引入工程改造的二硫鍵改善IgG抗體支架穩(wěn)定性的方法。天 然存在的IgG抗體是穩(wěn)定的分子。然而，對(duì)于一些治療應(yīng)用，可能需要進(jìn)行突變或產(chǎn)生非糖 基化分子。例如，非糖基化IgG分子可用于需要避免ADCC和與Fey受體結(jié)合的治療指征。 然而，非糖基化IgGl具有比糖基化IgGl低得多的熔融溫度（CH2域熔融溫度降低約10°C; 70°C至60°C)。觀察到的更低的熔融溫度負(fù)面地影響了非糖基化IgGl的各種生物物理特 性。例如，非糖基化IgGl具有比糖基化IgGl在低pH下增加水平的聚集。
[0343] 為了工程改造二硫鍵，基于結(jié)構(gòu)的涉及C-α原子間的距離計(jì)算的基于結(jié)構(gòu)的方 法初始用于鑒定Fc區(qū)中用于突變成Cys的54個(gè)殘基對(duì)。將這54個(gè)位點(diǎn)還進(jìn)一步縮小到 4 個(gè)殘基對(duì)（V259C-L306C、R292C-V302C、A287C-L306C和V323C-I332C)。所用的標(biāo)準(zhǔn)包括 (i)CH2域內(nèi)的位點(diǎn)；（ii)遠(yuǎn)離環(huán)、轉(zhuǎn)角和碳水化合物；（iii)遠(yuǎn)離Fey受體和FcRn相互作 用位點(diǎn)；（iv)溶劑可接觸性（優(yōu)選埋藏的位點(diǎn)）等。
[0344] 在非糖基化N297GFc的背景中產(chǎn)生成對(duì)半胱氨酸取代。非還原肽圖譜分析揭 示4個(gè)工程改造的位點(diǎn)中的3個(gè)形成了如預(yù)料和在該背景下設(shè)計(jì)的二硫鍵。V259C-L306C 突變沒(méi)有正確地形成二硫鍵并導(dǎo)致與存在與CH2域中的天然的二硫鍵錯(cuò)配。其它三個(gè)設(shè) 計(jì)R292C-V302C、A287C-L306C和V323C-I332C如預(yù)料地和設(shè)計(jì)地正確地形成了二硫鍵。 向N297G突變加入二硫鍵比單獨(dú)N297G突變導(dǎo)致約15C熱穩(wěn)定性改善。R292C-V302C、 A287C-L306C和V323C-1332C二硫鍵變體中，當(dāng)施用給大鼠時(shí)，R292C-V302C和A287C-L306C 具有良好的藥代動(dòng)力學(xué)（t1/2，分別在第11天和第9天）。這與我們?cè)诖笫笾嗅槍?duì)先前所 公開(kāi)的CH2域二硫鍵L247C-K339C觀察到的藥代動(dòng)力學(xué)特征形成對(duì)比（Gong等，J.Biol. Chem. 2009284:14203-14210)，其具有5天的t1/2。
[0345] 對(duì)CH2域中的二硫鍵進(jìn)行工程改造使得非糖基化分子的穩(wěn)定性得以改善，與糖基 化IgGl分子相當(dāng)（通過(guò)差示掃描量熱法測(cè)定的熔融溫度改善10至15°C)。本文描述的工 程改造的位點(diǎn)不會(huì)導(dǎo)致二硫鍵錯(cuò)配并且該二硫鍵以約100%的群體按照預(yù)期的形成。更重 要的是，與CH2域中所公開(kāi)的二硫鍵位點(diǎn)不同，本文所述的二硫鍵不會(huì)影響大鼠PK。
[0346] 測(cè)定食蟹猴中穩(wěn)定的非糖基化抗體的藥代動(dòng)力學(xué)（PK)特征圖。具有N297G、A287C 和L306C取代（Ab2-1)的IgGl抗體和具有N297G、R292C和V302C取代（Ab2-2)的IgGl抗 體以5mg/kg皮下注射給蟹猴（N= 2)。在給藥前、給藥后0. 5、2、8、24、48、96、168、336、504、 672、840、1008、1176、1344、1512和 1680小時(shí)采集血清樣品。使用抗-huIgG夾心ELISA法 測(cè)定樣品的Ab2-1和Ab2-2抗體水平。為了測(cè)量PK研究樣品中的血清huIgG水平，使用 以下方法：用2μg/ml的抗-huFc抗體1. 35. 1 (溶于PBS)涂覆1/2區(qū)域黑色板（Corning 3694)，然后在4°C下孵育過(guò)夜。然后洗滌板，并在4°C下用I_Block?(AppliedBiosystems) 封閉過(guò)夜。如果樣品需要稀釋?zhuān)瑒t用食蟹猴血清稀釋。然后用1:20的lXPBS+lMNaCl+0. 5% Tween20和1%BSA緩沖液（5 %血清）稀釋標(biāo)準(zhǔn)物和樣品。洗滌板并將稀釋的標(biāo)準(zhǔn)物和樣 品的50-μ1樣品轉(zhuǎn)移到用抗體1. 35. 1涂覆的板中并在室溫下孵育1. 5小時(shí)。洗滌板，加 入 50μ1 100ng/ml的抗-huFc抗體 21. 1-HRP綴合物（溶于I-Block?+5%BSA)并孵育 1.5小時(shí)。洗滌板，然后加入50μ1Pico底物，然后立即用光度計(jì)分析板。時(shí)間濃度數(shù)據(jù)使 用非隔室模型方法通過(guò)WinN〇nLin_?(企業(yè)版 5. 1. 1，2006, ⑩Corp.Mountain View，CA)分析。
[0347] 將食蟹猴中Ab2_l和Ab2_2抗體的PK暴露與僅包含N297G取代的IgGl抗體和包 含N297G、L247C和K339C的IgGl抗體相比較。食蟹猴中Ab2-1和Ab2-2抗體的PK暴露比 僅包含N297G取代的IgGl抗體和包含N297G、L247C和K339C的IgGl抗體都更高。另外， Ab2-2具有與親本IgGl抗體相當(dāng)?shù)谋┞逗颓宄省?br>【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種多肽，其包含人IgGl抗體的Fc區(qū)，其中所述Fc區(qū)包含N297G突變并且所述人IgGl的Fc區(qū)包含與SEQIDNO:3中所示氨基酸序列至少90%的同一性。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述人IgGl的Fc區(qū)包含與SEQIDNO: 3中所示 氨基酸序列至少95%的同一性。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述人IgGl的Fc區(qū)包含SEQIDNO:4中所示氨 基酸序列。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求3所述的多肽，其中所述人IgGl的Fc區(qū)還包含一個(gè)或 多個(gè)突變以使所述多肽穩(wěn)定。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的多肽，其中SEQIDNO: 3或SEQIDNO: 4中所示一個(gè)或多個(gè) 氨基酸被半胱氨酸所取代。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的多肽，其中SEQIDNO: 3或SEQIDNO:4中所示氨基酸序列 的V259、A287、R292、V302、L306、V323 或 1332 被半胱氨酸所取代。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的多肽，其中所述Fc區(qū)包含SEQIDNO: 3或SEQIDNO:4中 所示氨基酸序列內(nèi)的A287C和L306C取代。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的多肽，其中所述Fc區(qū)包含SEQIDNO: 3或SEQIDNO:4中 所示氨基酸序列內(nèi)的V259C和L306C取代。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的多肽，其中所述Fc區(qū)包含SEQIDNO: 3或SEQIDNO:4中 所示氨基酸序列內(nèi)的R292C和V302C取代。10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的多肽，其中所述Fc區(qū)包含SEQIDNO: 3或SEQIDNO: 4中 所示氨基酸序列內(nèi)的V323C和I332C取代。11. 一種抗體，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的Fc區(qū)。12. -種Fc融合蛋白，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的Fc區(qū)。13. -種核酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的多肽。14. 一種表達(dá)載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求13所述的核酸。15. -種宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求13所述的核酸。16. -種宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求14所述的表達(dá)載體。17. 根據(jù)權(quán)利要求15或權(quán)利要求16所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物宿 主細(xì)胞。18. -種多肽，其包含接頭，其中所述接頭為GGNGT(SEQIDN0:6)或YGNGT(SEQID NO:7)〇19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的多肽，其中所述接頭包含Ν-糖基化。20. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的多肽，其中所述接頭插入或置換所述多肽結(jié)構(gòu)中的環(huán)。21. -種制備含有非糖基化IgGlFc的分子的方法，所述方法包括： a) 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)編碼根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的多肽的核酸；和 b) 從所述培養(yǎng)物中收獲所述含有非糖基化IgGlFc的分子。22. -種制備在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)非糖基化的含有IgGlFc的分子的方法，所述 方法包括使所述Fc區(qū)中針對(duì)N297的密碼子突變?yōu)楦拾彼崦艽a子的步驟。
【專(zhuān)利摘要】本文提供了效應(yīng)子功能缺少或高度降低但在N297處缺少糖基化時(shí)仍具高穩(wěn)定性的變體人IgG1？Fe分子。此外，本文提供在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)被糖基化的接頭肽。IL-2結(jié)合三種跨膜受體亞單位：IL-2R-和IL-2Ry，兩者在IL-2結(jié)合時(shí)一起活化細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)事件；以及CD25(IL-2Ra)，其用來(lái)穩(wěn)定IL-2和IL-2RBY之間的相互作用。IL-2RBY遞送的信號(hào)包括PI3-激酶、Ras-MAP-激酶和STAT5途徑的那些信號(hào)。
【IPC分類(lèi)】C07K16/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105358570
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480027384
【發(fā)明人】G.肯南
【申請(qǐng)人】美國(guó)安進(jìn)公司
【公開(kāi)日】2016年2月24日
【申請(qǐng)日】2014年3月14日
【公告號(hào)】CA2905141A1, CA2906708A1, CN105143253A, EP2970423A2, EP2970441A1, US20140286898, US20140343252, WO2014153063A1, WO2014153111A2, WO2014153111A3